彗星试验方法

主要仪器数显电热恒温水浴箱电泳仪电子分析天平荧光显微镜及数码成像系统匀浆器磁力搅拌器主要试剂氯化镉CdCl225H2O分析纯上海亭新化工试剂厂批号20080901使用时用去离子水配制成不同浓度正常熔点琼脂糖NMA低熔点琼脂糖LMAN十二烷基肌氨酸钠TritonX100溴化乙锭EB氯化钠氯化钾磷酸氢二钠Na2HPO412H2O磷酸二氢钾KH2PO4乙二胺四乙酸二钠Na2EDTA三羟甲基胺基甲烷Tris氢氧化钠NaOH二甲基亚砜DMSO盐酸HCl等均为国产分析纯试剂主要溶液的配制磷酸缓冲液PBSNaCl8gKCl02gNa2HPO412H2O29gKH2PO402g无Ca2Mg2双蒸水1000ml调pH至74冰箱4保存备用05正常熔点琼脂糖NMA05gNMA与100ml磷酸缓冲液混合加热溶解冷却后冰箱4保存备用05低熔点琼脂糖LMA05gLMA与100ml磷酸缓冲液混合加热溶解冷却后冰箱4保存备用细胞裂解液精确称取NaCl1461gNa2EDTA372gN十二烷基肌氨酸钠10gTris122g放入1000ml烧杯中加800ml双蒸水磁力搅拌溶解可加热以4molLNaOH调pH到100在容量瓶中加水定容到1000ml冰箱4保存备用临用前根据用量按总体积加1TritonX10010DMSO混匀碱性电泳缓冲液Na2EDTA0186gNaOH6g加500ml双蒸水定容pH13现配现用TrisHCl中和液称取Tris4844g加600ml双蒸水溶解用浓盐酸约135ml调pH值至75加水定容到1000ml4保存备用EB染色液003mgml溴化乙锭EB30mg双蒸水100ml避光4保存备用试验分组染毒单细胞凝胶电泳试验在染毒第40d时各组小鼠摘眼球取血后打开胸腔左心室插管右心耳打一切口生理盐水快速灌流至动物尸体展开肢体变硬为止迅速取肺脏组织用冰冷的PBS漂洗三次至无血再用不锈钢剪刀将其剪碎加适量PBS液到玻璃匀浆器研磨并过300目不锈钢筛网得单细胞悬液然后以5000rmin离心5min轻轻吸去上层溶液再加PBS冲洗1次离心后将细胞浓度调整为106107个ml台盼兰染色镜检细胞存活率细胞存活率90以上立即进行以下步骤1胶板的制备第一层胶的制备将已预热56的80l05正常熔点琼脂糖NMA溶于无Ca2Mg2的磷酸缓冲液PBS滴到同样预热的载玻片的磨砂面迅速盖上干净的盖玻片4放置10min使其凝固第二层胶的制备取10l含1000个细胞的PBS和75l05低熔点琼脂糖LMA溶于无Ca2Mg2的磷酸缓冲液PBS在37混匀然后轻轻揭去盖玻片将含细胞的LMA滴到第一层胶板上立即盖上干净的盖玻片4放置10min使其凝固第三层胶的制备最后在凝固的LMA层上滴加85l预热37的05LMA盖上盖玻片使其凝固第一层胶的主要目的是使第二层平整和附着紧密第三层胶的目的是对第二层细胞起保护作用2细胞裂解移去盖玻片将载玻片浸入新配置的细胞裂解液中至少裂解1h在放第一片开始计时再以同样的顺序取出确保每张片子裂解时间相同此步骤的目的是溶解细胞膜及核膜除去蛋白质RNA等仅存留核骨架3DNA碱解旋细胞裂解后取出载玻片用PBS冲洗2次以去掉载玻片表面高浓度的盐然后将载玻片置于水平电泳槽中倒入新配置的碱性电泳缓冲液约覆过胶面025cm碱解旋20min以便使DNA在碱性条件下解螺旋形成单链DNA使DNA断链在电泳场中易于迁移4单细胞电泳在25v300mA条件下电泳20min5中和与染色电泳完毕后将载玻片取出滤纸吸干电泳缓冲液用TrisHClpH75中和15min然后每片载玻片上滴加50l30gmL的溴化乙锭EB溶液避光操作盖上盖玻片避光染色20min即可观察6试验结果观察与数据处理EB染色后的样本尽快在荧光显微镜下观察并拍照电泳图谱每只小鼠的肺组织制一张片子每张片子随机选择100个肺细胞计数各组小鼠肺组织的拖尾细胞数计算拖尾率并利用统计软件SPSS100进行X2检验每只小鼠的每张肺组织片子随机选择25个细胞利用CometAssaySoftwarePectCASP123be