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浅谈分子标记在园林植物遗传育种中的应用 摘要：分子标记是一种新型的遗传标记, 它为包括林木在内的植物遗传育种研究提供了新 的手段, 在缩短育种周期、提高育种效益等方面展现了广阔的应用前景。本文主要介绍分子标记在植物遗传育种中的应用原理及分析方法, 并对其应用前景进行了展望。 关键词：分子标记　园林植物　植物育种　遗传育种 １.前言 植物育种是人类征服自然、改造自然的一项伟大实践,其目的在于制定和运用合理可行的育种策略以正确有效地利用自然界大量植物种类中广泛存在的遗传变异,进而快速培育能满足人类生存需求、性状得到改良新的植物品种、类群或生态型。随着人类的进步,植物育种技术一直处于不断地发展之中,已从最初简单行为的选优淘劣演化为现今的综合育种技术的熟练应用;育成品种的质量表现以及可靠性等也都得到极大的改进和完善。 尽管如此,常规育种直至目前基本上还是全凭经验,在育种材料表型性状观察的基础上进行。这种表型性状除一少部分属于单基因决定的质量性状之外,大多数性状通常为复杂的多基因相互作用所致,其中还涉及到环境因子的作用。为此,植物育种过程中,育种材料遗传变异性的正确鉴定与选择,以及使原始材料有益的遗传信息在育成品种的遗传组成中得到最优化的表达便成为一个重要的问题。在这方面常规育种方法长期以来一直未能找到一个较为圆满的答案。 最近十余年时间内,迅速发展起来的分子标记技术不仅能在分子水平上直接测定遗传物质DNA的变异性,而且还能将正确的育种策略付诸实践加速育种进程,因而就成为现代育种技术的一个重要组成部分,为高效、准确、快速地培育品种展示出一幅极为诱人的前景。 分子标记的综述 ２.１分子标记的概念 分子标记是以植物遗传物质DNA分子的多态性为基础的遗传标记。与表型标记、生理标记、细胞形态标记、同工酶标记等传统的遗传标记相比,分子标记具有明显的优点:首先,传统标记一般以酶、蛋白质、特性、性状等基因表达产物为检测对象,而分子标记则直接检测遗传物质DNA ,抓住了生命最本质性的物质基础;其次,分子标记检验的样品可以是含DNA 的任意器官、组织或细胞,也不受环境条件的影响,结果准确,显示度高;第三,分子标记的数目可以是无限多的,而传统标记的数目都有一定的限制。作为一项高新技术,由于其潜在的价值,分子标记在诞生后的短短几年时间内就在植物染色体研究、植物育种等领域得到广泛应用。 ２.２分子标记的种类 分子标记种类较多,有RFLP(限制片段长度多态)、RAPD(随机扩增多态DNA)、STS(序列标记位点)、SSLP(简单序列长度多态)、QTL(数量性状位点)等,其中RFLP和RAPD已趋成熟,成为人们最常用的技术。 ２.２.１ＲＥＬＰ RFLP是Grodzicker于1974 年创立的。碱基的改变和染色体结构的变化会导致生物体或群体之间DNA 片段酶切位点的变化, 用特定的限制性内切酶切割不同个体或群体的DNA 可产生大小、种类、数目不同的片段, 通过与克隆的DNA 片段(探针) 进行Southern杂交和放射自显影等步骤可以检测到RFLP的存在。用作RFLP的探针有cDNA (即互补DNA, 用RNA 作模板通过反转录合成的DNA)与基因组DNA(gDNA)两种。gDNA是从植物基因组DNA 中克隆出来的。RFLP标记主要用于植物遗传连锁图的绘制和目标基因的标记。迄今为止, 各种作物的连锁图主要由RFLP标记绘制。RFLP的优点是: (1)可靠性高, 这是由限制性内切酶识别序列的专一性决定的; (2)具有共显性, 即能区别杂合体与纯合体。其缺点是: (1)具种属特异性, 在实际应用中受到限制; (2) 需要的仪器设备较多, 技术也较为复杂, 费时; (3)对DNA 的需要量大(5～ 10Lg) , 纯度要求高; (4) 多态性水平低。 ２.２ＲＡＰＤ 1990 年美国生物学家W illiams 创立了RAPD。它是以PCR (Polymo rase Chain React ion, 即DNA 聚合酶链式反应) 为基础, 由一系列人工合成的碱基顺序随机排列的寡核苷酸单链(一般为10bp ) 作引物, 以组织中分离出来的基因组DNA 为模板进行PCR 扩增。如果引物与某一片段的模板具有互补的核苷酸序列, 该引物就会结合到单链的DNA 上去, 通过DNA 聚合酶, 就会从引物3′- OH 端开始合成一段新的互补DNA链。在植物的整个基因组中, 某一引物可能会与单链DNA 的许多地方结合, 但只有在约2000 个bp 以内, 存在着反向平行的某一引物互补的双链DNA 分子时, 方能通过该引物合成1 条与该序列以内DNA 分子互补的新链, 且此新链可在下一次扩增循环中作为模板合成另一条新链。经过几次扩增理论上就可形成2n 条新链。扩增产物通过琼脂糖(A garo se) 凝胶电泳、分离和溴化乙锭(EB) 染色后, 可在紫外光下检测到新合成的且分子量大小不等的DNA 片段所形成的多态性带谱(也称DNA 指纹图) , 这些扩增片断片的多态性反应了基因组DNA 相应区域的多态性。 RAPD 的优点是简单易行, 需要的DNA 量极少(15ng～25ng) , 无放射性, 实验设备简单, 周期短, 因此受到研究者的普遍欢迎。目前该方法已广泛用于种质资源鉴定与分类、目标性状基因的标记等研究上。其缺点是: (1) 多数位点的标记带表现为显性的特点, 因此不能提供完整的遗传信息。(2) 该方法在一些作物上扩增产物的稳定性差。 ２.２.３ＡＦＬＰ 1993 年由荷兰的Zabeau 和VO S　博士发明的1 项技术。实际是RFL P 是PCR 相结合的1 种产物。它利用RFL P 的可靠性和PCR 的高效性, 对基因组DNA 酶切片段进行选择性扩增。由于不同材料的DNA 的酶切片段存在差异, 因而便产生了扩增产物的多态性。其实质是用两种或两种以上的酶切割DNA , 形成不同酶切位点的限制性酶切片段, 在所得的酶切片段上接上1 个人工接头, 作为PCR 扩增的模板。A FL P 兼具RFL P 和RA PD 的优点, 多态性强、具有较高的可靠性和重复性, 操作简便、速度快、DNA 用量少。因此,A FL P 被认为是迄今最有效的分子标记, 非常适合绘制品种的指纹图谱及进行分类研究。缺点是对模板反应迟钝, 成本高, 对技术要求苛刻。 ２.２.４ＳＳＲ SSR 又称微卫星DNA (m icro satellite DNA )。微卫星是由2 个～ 6 个核苷酸组成的重复单位串联排列而成的DNA 序列。如(GA ) n、(AC) n、(GAA ) n (n 为重复次数)。据估计, 在真核生物基因组每10kb 的DNA 序列中至少有1 个微卫星。玉米每个基因组含有104～ 105 拷贝的(GT ) n 和(A q) n。水稻基因组中广泛分布着A qqC 微卫星DNA。A li 等人1986 年首次用合成的qA TA ö qACA 寡核苷酸做探针用于人的DNA 指纹分析。1988 年Schafer 进一步发展了这一技术。该方法是利用微卫星DNA 引物进行PCR 反应, 通过琼脂糖电泳分离扩增产物, 经EB 染色后进行显色反应, 有时也可用放射性同位素进行显带。引物是通过对某一物种的DNA 序列克隆并经过序列分析后设计的。目前SSR 标记已广泛用于资源鉴定, 连锁图绘制及目标性状基因的标记等研究上。它具有以下优点: (1) 共显性; (2) 多态性高。如qregan (1994) 在96 份大豆资源中发现了多达29 个SSR 的等位变异, 而通常利用RFL P 技术, 仅能发现2 个～ 3 个等位变异。缺点是引物设计非常费时、耗资。 ２.２.５ＩＳＨ 这是1969 年建立和发展起来的利用标记的DNA 探针与染色体上的DNA 杂交, 直接在染色体上定位基因和DNA 序列的1 种技术。原位杂交最大的优点是准确、直观。目前该技术主要用于检测外源染色体, 研究物种的起源、演化、构建染色体的物理图谱等。由于研究的目的不同, 使用的探针也不同, 基因组总DNA和基因组特异重复序列主要用来鉴定外源染色体和研究起源和演化, 低拷贝和单拷贝探针主要用来构建染色体物图谱。这项技术已引起越来越多研究者的兴趣, 并取得了许多很好的研究结果。 ３.分子标记在植物育种中的作用 ３.１绘制品种、品系的DNA 指纹图谱 　　指纹图谱是鉴别品种、品系的有力工具。它具有迅速、准确等优点。指纹图谱技术在监测良种质量(真伪、纯度) , 防止伪劣种子流入市场, 保护我国名、优、特种质及育种品种的知识产权和育种家的权益方面, 具有重要的意义。当前用作DNA 指纹图谱的标记主要有RFL P、小卫星DNA、微卫星DNA、A FL P、RA PD 等。L iu(1992) 在小麦基因文库中筛选到了1 个4. 1kb的DNA 克隆pTag546, 用该克隆作探针能够检测小麦10 条染色体上12 个位点的等位变异, 区分出全部参试的56 个普通小麦品种。Weising(1992) 发现微卫星DNA(qATA ) 是1 个多态性高、稳定性好的探针。用该探针可以检测出15 个栽培番茄品种的差异。Milgroom(1993) 的研究发现, (qA TA ) 4 在油菜上也表现出非常高的多态性, 它不仅能够检测出油菜品种间的差异, 而且可以检测出同一品种内不同单株间的细微差异。 ３.２种质资源遗传多样性的研究 分子标记是检测种质资源遗传多样性(genetic diversity) 的有效工具。分子标记技术不仅能够检测种内的遗传多样性, 而且可以对种间的遗传多样性进行比较。目前此类研究已有不少报道。 ３.３种质资源的创新与鉴定 通过远缘杂交导入外源遗传物质, 是扩大遗传变异的1 个重要途径。但是在外源染色体上, 既有对植物改良有利的基因, 也存在大量的对植物改良不利的基因, 这就需要1 种准确有效的识别方法对其进行鉴定。RFLP、PCR、原位杂交、RAPD 等技术, 均可有效地解决这一问题, 特别是把原位杂交技术与RFLP等项技术结合起来效果更好。 ３.4　分子标记辅助选择 ４.１质量性状的选择 　　许多重要的农艺性状表现为质量性状的遗传特点, 如抗病性、抗虫性、育性、某些抗逆性(抗盐、抗旱) 等。质量性状一般有显隐性, 因而在分离世代无法通过表型来识别目的基因位点是纯合还是杂合的。利用与目标质量性状基因紧密连锁的分子标记, 是进行质量性状选择的有效途径。Tanksley 等(1989) 在番茄上利用分子标记进行回交选择, 仅需30株单株, 回交3代, 便可选择到回交亲本类型的材料,而常规方法则需要数百株单株, 回交6代～ 8代。 ４.２数量性状的选择　 　　大多数重要的农艺性状均表现为数量性状的遗传特点, 如产量、成熟期、品质等。数量性状易受环境条件影响, 因此选择效果不好。传统育种方法周期长, 主要就是由数量性状造成的。近年来由于分子标记技术的发展, 人们已可能将复杂的数量性状进行分解, 像研究质量性状基因一样对控制数量性状的多个基因分别进行研究。如Xu (1995) 利用RFL P 标记, 发现了1 个优良的高梁抗旱品种的抗旱基因是由3 对主基因控制的, 并将这3 对基因定位在染色体上, 找到了与其连锁的分子标记。一经建立数量性状位点(Q TL ) 和分子标记之间的连锁关系, 就有希望利用分子标记对数量性状进行选择。 ４.结语 　　从以上分子标记技术在植物育种中的应用看,分子标记辅助育种比传统的形态选择有许 多优越性,并且使许多仅靠形态选择不能进行的问题得以解决。它比传统的常规育种受环境 影响小,节省了人力,缩小了选择群体,缩短了时间,提高了选择的准确性与精确性。但要将分子标记广泛而深入地应用到遗传育种的各个领域,还应注意以下几个方面: ①寻找新型的分子标记; ②简化分子标记技术, 降低成本, 实现检测过程的自动化; ③改进分析基因组的方法和技术。相信随着分子标记技术的日臻完善, 分子标记必将在植物育种中发挥越来越重要的作用。 目前世界各国的作物育种正在向分子标记辅助育种方向发展。自90 年代以来,我国也在这方面开始起步。当我们进入21 世纪时,分子标记辅助育种将成为作物育种的主要手段。希望我们的育种工作者尽早掌握分子标记方面的原理和技术,为适应多出、快出新品种的目标而努力。