生物工程论文 红花酢浆草提取物.doc

1IMG256IMG256IMG256timg毕业设计论文红花酢浆草提取物对金黄色葡萄球菌的抗菌研究学院名称学院名称专业名称专业名称学生学号2016123456789学生姓名学生姓名指导教师教授姓名助理指导老师老师姓名2020年1月2红花酢浆草提取物对金黄色葡萄球菌的抗菌研究学生学号指导老师摘要本研究通过细菌感染秀丽隐杆线虫探索红花酢浆草提取物的体内抗菌作用用金黄色葡萄球菌感染同步化的秀丽隐杆线虫配制含有不同浓度的红花酢浆草提取液的培养基将感染后的线虫置入培养基上培养观察与普通NGM培养基培养的线虫相比较根据线虫存活时间评价红花酢浆草提取物的体内抗菌药效制备红花酢浆草提取物采用圆滤纸片法测定其对金黄色葡萄球菌的抗菌效果为新的抗菌药物的开发提供实验依据关键词红花酢浆草秀丽隐杆线虫同步化体内抗菌金黄色葡萄球菌体外抗菌引言秀丽隐杆线虫Caenorhabditiselegans属于线形动物门线虫纲动物秀丽隐杆线虫生活在泥土中以细菌为食易于培养绝大多数个体为雌雄同体其一生可产生大约个受精卵只有极少数为雄性秀丽隐杆线虫非常小身体透明成虫只有毫米左右身体直径约为700微米从受精卵发育成可以产卵的成虫它只需要天平均寿命大约为3周线虫结构简单细胞数固定雌雄同体成虫仅有959个体细胞雄性成虫有1031个体细胞有302个神经细胞大约为体细胞的三分之一秀丽隐杆线虫虫体在530的温度均能生长NGM培养基比较适合虫体生长虫体在液氮中可以长期保存线虫因其细胞数量少结构简单生命周期短易于培养试验操作简单通体透明易于观察等生物学特征而被作为现代生物学方面研究的理想模式生物因此用秀丽隐杆线虫进行试3验是一种较好的选择由于抗生素的出现细菌感染性疾病得到控制但却促进了耐药性细菌的增长甚至出现了超级细菌严重困扰人类的健康这种现象迫使人们要不断开发新的抗菌药物中药是我国特有的资源用于治疗细菌感染性疾病已经有千年的历史而且与抗生素相比不易产生耐药性我国中草药具有资源丰富种类繁多分布广泛不易产生耐药性毒副作用小取材方便经济实惠等优点有着很广阔的应用前景一些中草药体外试验没有明显的抗菌效果但确有很好的体内抗菌作用因此对中草药抗菌功能的研究不能仅停留于体外抑菌试验应同时注重中草药的体内抗菌作用红花酢浆草是酢浆草科酢浆草属多年生草本植物株高地下具球形根状茎掌状复叶基生具长柄有小叶小叶呈倒心形伞状花序小花朵小花瓣浅粉红色晴天早晨开放晚上闭合花期从月上旬月中旬达个月红花酢浆草因其植株整齐花叶繁茂花色艳花期长等诸多优点是校园中广泛种植的地被植物之一红花酢浆草全草具有清热解毒消炎止痛利湿消肿等功效红花酢浆草根还可以清热平肝定惊主治小儿肝热惊风等症状红花酢浆草的主要成分为有机酸黄酮类等杨红原等研究红花酢浆草化学成分首次从红花酢浆草中获得谷甾醇胡萝卜苷酒石酸苹果酸柠檬酸本实验通过对红花酢浆草抗菌作用进行研究希望为新的抗菌药物的开发提供实验依据1材料与方法11实验材料N2野生型秀丽隐杆线虫CeleganstheBristolstrainN2大肠杆菌Escherichiacoli金黄色葡萄球菌红花酢浆草均由抗衰老中草药安徽省工程技术研究中心提供12主要试剂药品氯化钠国药集团化学试剂有限公司蛋白胨国药集团化学试剂有限公司琼脂粉北京奥博星生物技术有限责任公司磷酸氢二钾国药集团化学试剂有限公司磷酸二氢钾国药集团化学试剂有限公司硫酸镁国药集团化学试剂有限公司氯化钙广东汕头市西陇化工厂胆固醇国药4集团化学试剂有限公司蒸馏水抗衰老中草药安徽省工程技术研究中心提供磷酸氢二钠十二水国药集团化学试剂有限公司庆大霉素河北新张药有限公司氢氧化钾国药集团化学试剂有限公司氢氧化钠汕头市西陇化工有限公司次氯酸钠淮南市化学试剂厂乙醇上海振企化学试剂有限公司牛肉膏国药集团化学试剂有限公司等13主要仪器设备自动双蒸水蒸馏器SZ2上海沪西电子天平FA2104N上海民桥高压蒸汽灭菌锅MLS3750日本Sanyo超净工作台苏州净化电热恒温干燥箱上海精宏低温冰箱日本Sanyo微波炉KD21B广州美的台式离心机珠海黑马数显生化培养箱250B江苏金坛变焦体视显微镜XTJ4700中国江南数码相机Digimaxi6等主要试剂配制141培养基培养基取一洁净的的锥形瓶用电子天平分别称取氯化钠蛋白胨琼脂粉转移到锥形瓶中再加入蒸馏水磷酸氢二钾磷酸二氢钾封口后放在高压灭菌锅中灭菌灭菌后的培养基在超净工作台中分别加入抽滤除菌的胆固醇溶液乙醇的硫酸镁溶液的氯化钙溶液摇匀后在超净工作台中冷却凝固备用14含红花酢浆草提取物的培养基用等量的红花酢浆草水醇提取物代替蒸馏水按培养基的配制方法配制不同浓度梯度的培养基142牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基取一洁净的大烧杯在烧杯中先加入少于所需要的水量用电子天平依次准确地称取牛肉膏06g蛋白胨2g氯化钠1g放入烧杯中然后在石棉网上加热使其溶解用玻棒搅匀待药品完全溶解后将称好的35g琼脂加入已溶化的药品中再加热溶化转移到的锥形瓶中润洗烧杯补充水分到所需的总体积用pH试纸测量培养基的pH值向培养基中逐滴加入1moLL氢氧化钠或者1moLL盐酸边加边搅拌随时测其pH值直至pH达7072143缓冲液5L缓冲液含磷酸氢二钠十二水磷酸二氢钾氯化钠硫酸镁七水宜现用现配144LB培养基培养基蛋白胨酵母浸提物氯化钠蒸馏水调至145裂解液100mL裂解液100mL蒸馏水中溶有5moLL氢氧化钾10mL和10次氯酸钠10mL实验方法红花酢浆草水醇提取方法水提法红花酢浆草洗净晾干于烘箱中至恒重取一干净的mL烧杯将电子天平调零后称取红花酢浆草用量筒量取mL蒸馏水倒入烧杯中浸泡30分钟后煎煮待沸后小火加热10分钟过滤并收集滤液重复3次将3次滤液3500rmin离心10分钟取上清液定容至100mL此时生药浓度为50抽滤除菌待用醇水提法取5烘干至恒重的红花酢浆草加50乙醇50mL浸泡30分钟后煎煮小火加热保持沸腾约10分钟过滤并收集滤液药渣中再加入50乙醇50mL煎煮待沸后小火加热10分钟后过滤收集两次滤液将2次滤液3500rmin离心10分钟取上清液定容至100mL此时生药浓度为50抽滤除菌待用大肠杆菌金黄色葡萄球菌的培养配制mLLB培养液灭菌后接种大肠杆菌菌种与摇床中震荡小时静置小时弃上清与培养箱中备用配制mLLB培养液灭菌后接种金黄色葡萄球菌菌种与摇床中震荡小时静置小时弃上清与培养箱中备用大肠杆菌金黄色葡萄球菌的接种在超净工作台中将加热溶化后培养基倒平板待充分冷却用移液枪吸取少量的大肠杆菌母液注入培养皿上将涂菌棒在酒精灯上加热烧红待充分冷却后将大肠杆菌菌液在培养基上涂布均匀将培养皿放在培养箱中培养小时备用6在超净工作台中将加热溶化后牛肉膏蛋白胨培养基倒平板待充分冷却用移液枪吸取少量的金黄色葡萄球菌母液注入培养皿上将涂菌棒在酒精灯上加热烧红待充分冷却后将金黄色葡萄球菌菌液在培养基上涂布均匀将培养皿放在培养箱中培养小时备用线虫同步化将秀丽隐杆线虫接入培养小时大肠杆菌的NGM平板上于20培养箱中培养3天在超净工作台中用mL缓冲液从培养基上冲洗线虫至离心管中点动分钟弃去上清液再加mL缓冲液冲洗一次弃上清液加mL裂解液上下颠倒混匀分钟后离心分钟弃上清液用缓冲液冲洗3次后卵置于M9溶液中与培养箱中培养个小时获得同步化一龄幼虫L1个小时后在超净工作台中把线虫卵分别接种到已培养好的大肠杆菌OP50的NGM平板中将培养皿放在培养箱中培养小时发育成四龄幼虫L4观察其生长情况线虫感染将同步化得到的四龄幼虫L4于超净工作台中用缓冲液洗脱虫体并反复冲洗次后将虫体接种到已培养好的金黄色葡萄球菌的培养基中在培养箱中培养小时进行感染用缓冲液洗感染后的线虫并反复冲洗次后将线虫转移到孔板的含有红花酢浆草水提物浓度分别为mmL以及对照的培养基上继续培养每孔条观察每日死亡情况记录在表抑菌圈的测定将金黄色葡萄球菌菌悬液取mL分别涂布于两组相应编号为的培养基中制成含菌平板在超净工作台中采用圆滤纸片法取已高压灭菌的圆滤纸片第一组浸入浓度为mgmL红花酢浆草水提液中第二组浸入浓度为mgmL红花酢浆草醇提液中浸泡分钟后取出晾干后将滤纸片贴在含菌平板上各滤纸片的距离大致相等纸片距平板边沿大于第一组用灭菌蒸馏水设阴性对照第二组用灭菌的乙醇设阴性对照庆大霉素做阳性对照每一组做个平行将平板置于的恒温箱中培养小时用直尺测其抑菌直径取个平行的平均7值结果与分析21线虫观察感染前感染后线虫存活情况观察并记录秀丽隐杆线虫每日的存活情况如表表秀丽隐杆线虫每日的存活情况记录表计量单位条数浓度mgmL天数08040201005002500125对照组水提水提水提水提水提水提水提150505050505050502505050505050505034042454939404030431353940333425185202025302218128603684330700000000根据表可以看出酢浆草水提物浓度为mmL时线虫存活情况较好将同步化得到的四龄幼虫L4于超净工作台中用缓冲液洗脱虫体并反复冲洗次后将虫体接种到已培养好的金黄色葡萄球菌的培养基中在培养箱中培养小时进行感染用缓冲液洗感染后的线虫并反复冲洗次后将线虫转移到孔板的含有红花酢浆草水提取物浓度分别为mmL以及对照的培养基上继续培养每孔条每一浓度做个平行观察每日死亡情况记录在表观察并记录秀丽隐杆线虫每日的存活情况如表8表秀丽隐杆线虫每日的存活情况记录表计量单位条数浓度mL天数对照根据线虫表秀丽隐杆线虫每日的存活情况记录表取每一浓度个平行的平均值绘制图线虫存活情况条形图图线虫存活情况条形图根据表及图可以得出以下结论种浓度下的水提物的抗菌效果最佳浓度为mmL根据表及表发现红花酢浆草水提物有体内抗菌作用红花酢浆草水提物的抗菌效果随提取物的浓度升高而上升但超过一定浓度抗菌效果随浓度升高而下降抑菌圈的测定结果抑菌圈的测定结果9表抑菌圈直径测量表计量单位毫米浓度mgmL编号对照庆大霉素水提醇提水提醇提水提醇提水提醇提水提醇提水提醇提平均值讨论红花酢浆草是一种兼具观赏与药用价值的草本植物目前对于酢浆草的抗菌研究多数是在体外但抗菌药物大多作用于体内因此在探索研究酢浆草抗菌作用时只有更重视体内抗菌实验的研究酢浆草才有可能作为一种新型抗菌药物推广本实验主要是对秀丽隐杆线虫感染金黄色葡萄球菌研究红花酢浆草水提物对线虫体内抗菌作用的影响秀丽隐杆线虫的感染时间是本实验过程中重要的环节同步化的线虫感染金黄色葡萄球菌时线虫的体型会随着感染时间的长短发生变化在感染后最初的个小时线虫体型基本上没有什么变化感染时间一般为个小时随着感染时间的增长线虫长度不变但会逐渐变细而且会出现几条虫首尾相接连成一条线或者环化等行为不利于挑虫用金黄色葡萄球菌感染同步化的秀丽隐杆线虫研究红花酢浆草水提物对线虫体内抗菌作用的影响通过分析秀丽隐杆线虫每日的存活情况发现红花酢浆草水提物有体内抗菌效果抗菌效果随提取物的浓度升高而上升但超过一定浓10度抗菌效果随浓度升高而下降最佳浓度为mmL通过抑菌圈的测定研究红花酢浆草水醇提取物对金黄色葡萄球菌的体外抗菌作用从实验结果显示酢浆草水醇提取物具有体外抗菌作用但是通过抑菌圈的测定研究红花酢浆草水醇提取物对细菌的体外抗菌作用时发现抑菌圈的直径大小与红花酢浆草水醇提取物的浓度大小之间没有呈现一定的线性关系造成这种结果的原因可能是有一部分浸泡的圆滤纸片取出后未完全晾干带有多余的液体贴在含菌平板上对抑菌圈的大小造成了一定的误差本实验在研究探索红花酢浆草提取物的抗菌作用时只选用了金黄色葡萄球菌虽然结果显示酢浆草有抗菌作用但只能说明酢浆草对金黄色葡萄球菌有抗菌作用还应选择更多的细菌加以验证参考文献庞林海杜爱芳李孝军等秀丽隐杆线虫培养特性与保存方法研究浙江农业学报秦峰松杨崇林小线虫大发现在生命科学研究中的重要贡献生命科学赵晴蒋湉湉秀丽隐杆线虫的研究综述安徽农业科学赵娜任长虹刘虎岐张成岗秀丽隐杆线虫学习行为研究方法西北农林科技大学学报杨再昌杨小生秀丽隐杆线虫在药物筛选中的应用生命科学杨再昌马小彦乐意牛玉乐乔冲用秀丽隐杆线虫观察种中药的体内抗菌药效时珍国医国药马建凤刘华钢朱丹中药体外抑菌研究的方法学进展杨红原赵桂兰王军宪红花酢浆草化学成分的研究西北药学杂志陈俊愉程绪珂中国花经上海上海文化出版社张良张彩莹何民桢红花酢浆草在园林绿化中的应用中国野生植物资源中国医学科学院药物研究所中草药有效成分的研究第一分册北京人民卫生出版社刘世旺徐艳霞石宏武酢浆草乙醇提取物对细菌生长曲线的影响北方园艺11孙涛李兰生胡现龙五种中草药对海洋光合细菌生长情况的影响海洋湖泽通报姜新发中草药提取物对水生动物常见病原菌的体外抑菌试验饲料工业王成涛籍保平朱桂华等五味中草药对乳酸菌生长保存活力的影响中国微生态学杂志王晓平段丽菊陈晓白李丽梅陆奇丰李鉴清五指毛桃水提液体外抗菌作用的实验研究时珍国医国药AntibacterialofextractonStaphylococcusaureusNamePanyaliStudentNumber200740810233AdvisorQuchangqingAbstractThisstudywastoexploreinvivoantibacterialeffectofextractsbybacteriuminfectingCaenorhabditiseleganswithStaphylococcusaureusinfectingtheCaenorhabditiselegansPreparedcontainingdifferentconcentrationsofextractmediumCaenorhabditiselegansinfectedwasVaccinatedintothemediumandobservetocomparewithcommonnematodesNGMculturemediumEvaluatetheantibacterialefficacyinvivoCaenorhabditiseleganssurvivalunderextractPreparationofextractsfromDeterminationofroundfilterpaperwithitsantibacterialeffectofStaphylococcusaureusForthedevelopmentofnewantimicrobialagentstoprovidetheexperimentalbasisKeywords致谢从开始进入课题到论文的即将完成一共经历了四个多月的时间在这里我首先要由衷地感谢我的导师无论是在论文的选题文献查阅开题以及实验的每一个环节屈老师都给予指导特别是他广博的学识深厚的学术素养严谨的治学精神和一丝不苟的工作作风使我终生受益在论文的撰写及定稿方面帮12我反复的审阅修改才使我能够顺利的完成毕业设计论文在论文即将完成之际我清楚的知道我的大学生活也即将落幕回首四年感慨良多我要向我的辅导员刘晓娟老师所有的任课老师所有帮助过我的师长说一声你们辛苦了感谢你们四年来对我的培养给我的鼓励传授的知识在这四年当中我所学到的是我一生的财富感谢我的同学在这最宝贵的四年中你们伴我成长给我帮助共同留下了许多美好的回忆在这里请接受我诚挚谢意感谢我的家人为我提供精神与物质的支持使我顺利的完成学业同时也感谢学院为我提供良好的做毕业设计的环境