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科技论文 大肠杆菌质粒DN A 提取方法的优化 作者 姓名： 班级;生命科学系 生物技术专业 学号: 2011．9.9 大肠杆菌质粒DNA提取方法的优化 摘要: 目的: 简化操作流程, 缩短提取时间, 降低试验对操作者的危害。方法: 该方法去除酚、氯仿等有害试剂, 采用Licl沉淀去除质粒制备物中小片段核酸( 包括DNA 和RNA) ; 工程菌生长至对数期时通过加入氯霉素后不仅方便质粒DNA 的提取过程中蛋白质的去除, 而且可使质粒的拷贝数进一步增加, 提高质粒DNA 产量的目的。结果: 实验改进方法所提取的质粒DNA 产量高于常规方法,达到20LgPmL。结论: 改进方法提取的质粒DNA, 其下游的内切酶消化, PCR、重组质粒鉴定、转化大肠杆菌等实验的结果和重复性都令人满意, 完全可用于一般的分子生物学研究。 关键词: 质粒; DNA 提取; 方法改进; 纯化 引言：大肠杆菌质粒DNA 的提取和检测在分子生物学中是常见的实验, 常规的碱裂解法提取质粒DNA 产物中常带有影响酶切等下游实验的大量蛋白质和盐等污染物, 提取的程序比较复杂, 所使用的试剂对人体有害, 并且得率相对较低, 实验结果也很不稳定[1- 4] 。本实验的创新的点在于结合了常规碱裂解法和Mini 质粒提取的优点, 在工程菌生长至对数期时加入氯霉素抑制细菌蛋白质的合成,但不影响松弛型质粒DNA 的复制, 为质粒DNA 的提取过程中蛋白质的去除提供了方便, 还可以达到提高质粒DNA 产量的目的, 由于细菌长期受到抑制使裂液中的黏稠度显著降低, 向培养基中添加氯霉素比处理黏稠的裂解液更方便, 同时利用Licl沉淀RNA, 并简化操作流程, 使提取时间缩短, 并且在操作过程中去除了酚、氯仿等对人体有害的试剂, 使试验本身对操作者的危害得以降低, 从建立了一套完整、便捷、质粒DNA 得率和纯度高、且相对比较安全的大肠菌质粒DNA 的提取方法, 可直接用于PCR 和限制性酶切等分子生物学实验操作。 1材料与方法 材料 实验试剂 1.各种常规化学试剂均为分析纯。 2. 氨苄青霉素(Amp) : 配成50mgPmL 水溶液, - 20 e 保存备用。 3. LB培养基 4. RNA 酶A 母液: 将RNA 酶A 溶于10mmolPL Tris- Cl( pH7. 5) 15mmolPL NaCl, 配成10mgPmL 的溶液, 于100 e 加热15min, 使混有的DNA 酶失活, 冷却后用1. 5mL ep 管分装保存 5. LiCl( 8molPL) : 100mL。 6. NH4AC( 8molPL) : 100mL。 仪器: 离心机; PCR 仪; 凝胶成像系统。 方法 1.含重组质粒DNA 细胞的培养与收集将含有质粒CyPA 的M15 菌种接种在LB 固体培养基( 含50LgPmL Amp) 中, 37 e 培养12- 16h。挑取转化细胞的单菌落,接种到50mL LB 液体培养基( 含50LgPmL Amp) 中, 37 e 振荡培养约12- 16h( 菌液生长到对数期OD600 = 0. 4- 0. 6 在培养液中添加适当体积的34mgPmL 的氯霉素, 使其终浓度为170LgPmL) 。 2. 优化的碱裂解法提取质粒DNA ( 1) 12 000rPmin 离心30s, 收集1. 5mL 培养物中的菌体, 尽量弃尽上清, 倒置片刻; ( 2) 将细菌沉淀重新悬浮于1mL 用冰预冷的STE 中, 同上离心( 此步可以重复) 。 ( 3) 加入100Ll 溶液Ñ, 在涡旋器上使菌体充分重悬; 或用微量移液器混匀; ( 4) 加入200Ll 溶液Ò, 立即将离心管缓慢颠倒数3- 5 次直到溶液变澄清, 冰浴2min; ( 5) 加入150Ll 溶液Ó, 缓慢颠倒离心管3- 5 次直至白色絮状物充分形成, 冰浴2min; ( 6) 12 000rPmin 离心2min 后将上清转入另一管中, 加入2V的800Ll 95%乙醇, 混匀, 静止5min, 12 000rPmin 离心3min; 弃 上清。 ( 7) 加入200Ll TE 溶解沉淀, 然后再加入100Ll 冰预冷的8molP LiCl 溶液和100LL 冰预冷的8molPL 的NH4AC, 冰浴10min后12 000rPmin 离心3min, 使RNA 和大量蛋白质杂质沉淀; ( 8) 取上清, 加入RNA 酶A 母液, 使得最终RNA 浓度为20LgPmL, 37 e 保温5- 10min。 ( 9) 加入2 倍体积的95%乙醇, 混匀, 静止5min, 12 000rPmin离心3min; 弃上清。70%乙醇洗涤后12 000rPmin离心2min;弃上清, 置于37e 培养箱干燥5min, 用30Ll 的TE 溶解DNA 沉淀, - 20 e 保存备用; ( 10) 取适量质粒DNA 用于分光光度计定量。 3 .重组质粒DNA 的电泳检测制备0. 8%琼脂糖凝胶, 取1Ll 样品进行凝胶电泳检测。以传统的碱裂解方法所提的质粒DNA 做对照。 4 .重组质粒DNA 的限制性核酸内切酶检测酶切方法见5分子克隆实验指南6 第三版[2] 。 5. 质粒DNA 的定量及杂质检测采用分光光度计法, 样品稀释100 倍后, 分别测定OD260 和OD280 值, 若OD260POD280 > 1. 8, 表明DNA 中含有RNA 杂质; 若OD260POD280 < 1. 6, 表明样品中含有蛋白质等杂质; OD260 = 1. 0时, 相当50LgPmL 的DNA。 6 .重组质粒DNA 的PCR 检测[ 2]按以下次序, 将各成分加在0. 5mL 灭菌扩增管中混合:10@扩增缓冲液 5Ll20mmolPL 4 种dNTP 混合液( pH8. 0) 2Ll25LmolPL 正向引物2Ll25LmolPL 反向引物2Ll1- 5UPLL Taq DNA 聚合酶3LlddH2O 30Ll模板DNA 2Ll1. 5mmolPLMg2+ 5Ll总体积50Ll按以下程序进行PCR 扩增。预95e7min; 95e 50s,57 e 50s, 72 e 50s 30 个循环; 72e 7min 4e for ever。 结果与分析 1. 质粒DNA 电泳检测 改进质粒提取方法的得率优于传统的方法, 而且质粒DNA 的质量好, 主要以超螺旋形式存在, 几乎无RNA 杂质, 而常规方法所取得的质粒的RNA 含量较高, 而且常规碱裂解法所提取的DNA 主要以缺刻形式为主, 说明DNA 的状态受到了极大的影响。 质粒DNA 的电泳图谱Lane 1: 改进的方法提取的质粒DNA; Lane 2、Lane 3: 未改进的碱裂解法 提取质粒DNA。 2. 质粒DNA 的酶切电泳检测 重组质粒DNA 被酶切成两个正确的目的片段。用改进方法所提取的质粒DNA 完全可以满足限制性核酸内切酶进行酶切的要求。 3.重组质粒DNA 的PCR 检测 PCR 检测改进方法所提取重组质粒DNA, 图3 可知, 扩增出目的大小为700bp 的片段。以上结果表明, 用改进的方法提取的质粒DNA 也同样可用于一般的分子生物学如进行限制性核酸内切酶, PCR 等实验的要求。 4. 重组质粒DNA 的定量检测 测得改进方法提取的质粒的OD260 = 0. 979, OD280 = 0. 547,质粒D