elisa的质量控制

ELISA 的质量控制 从 1949 年美国 College of American Pathologists 《简称 CAP) 首先开始研究 临床实验室室内质量控制(简称质控) 问题, 美国学者 Levery 和 Jenn ing 于 1950 年发表第一篇关于使用质控图的实验室室内质控, 临床检验实验室的室内质控工 作正式拉序幕- 到70 年代，实验室质量控制进入一个新的阶段-全面质量管理，推行 Good Laboratory Parctice (简称 GLP)。进入 80 年代末期，GLP 的统一标准产生了， 发展到"认证实验室"管理阶段。 全面质量管理的宗旨在于预防差错的产生。 质控图的统计学质控的目的是检 出差错。统计学的实验室室内质控是全面质量管理中的一个重 要环节。 本章节主要介绍免疫学检验的统计学室内质控方法。因为 ELISA 是目前临 床上最常用的一种免疫学检验方法，就以 ELISA 检验为例,介绍一下有关问题。 卫生部临床检验中心免疫质控室从 1988 年开始在全国范围内开展乙肝标 志物检验的质量评价活动, 一直采用这一套质量评价方法, 并在实践中不断实践、 提高和完善， 希望能找出一条适合中国国情的，行之有效的质量管理的道路- 5.1 基本概念 5.1.1 质量控制 (Quaility ControLQ.C) 质且控制是监视全过程，排除误差， 防止变化，维持标准化现状的一个管理 过程。这一过程是通过一个反馈环路进行的。 1) 确定控制的对象， 2) 规定控制对象的标准〈预期值); 3) 制定或选择控制方法和手段， 3) 测量实际数据， 4 ) 比较或较对实际数据与预期值之问的差异,并说明产生这一差异的原因。 超出预定误差范围，报警系发出信号，反馈通道中断。 5) 采取行动，解决差异。恢复原状〔原标准状态) 的手段发挥作用。 质量控制主要采用质控图进行。 质控图是把某一检验的性能数据与所计算出 来的预期的“控制限"进行比较的图。这种性能数据是在按规程正常进行时，按 时间顺序而抽选出来的，其目的是检测检验过程中变异的"可追查"” 性原因。"可 追递"性的误差原因，是指除去随机误差以外的其他原因。 "控制限"是通过统计 计算出来的，在后我们将详细介绍〔见 5 3.室内质控程序)。 5.1.2 误差 实验误差分为三种:系统误差、随机误差和过失误差。 系统误差是指一系列测定结果与真值或邯值存在有同一倾向的误差, 有明显 的规律性，可在一定条件下重复出现，是可以通过质控预防和 校正的。 随机误差又称偶然误差，是一种偶然的、未能预料到的误养，是难以避免和 校正的误差。检验工作中随机误差的分布符合正态分布规律 过失误差是人为的责任误差.通过加强实验室管理和开展质量控制工作是可 以避免的。 5.1.3 正态分布及标准差 ELISA 试验中，检验同一样本达 20 次以上时，就会发现这组数据〈指测定 结果的吸光值) 分布在均值两侧，大部分集中在均值附近 。如果以测定值为横  坐标，以出现的频率为纵坐标作图，就可绘出一个呈钟形的曲线图。如图 5-1， 钟项处为均值，其他值以均值为中 心对称分布，这就是正态分布。 正态曲线以下的面积称概率，常用样本的均数 (X) 和标准养 (SD) 来表示， 其计算方法如下: 均值、标准差和概率的关系如下: X+1SD，概率 0.68，X+2SD，概率 095，X+3SD，概率 0.99 换言之，当 ELSIA 检测同一样本达一定次数后所得的一组数据，其中华近 均值 (X) 的+1SD 范围内的数据，占该组数据的 68%，在 X+2 SD 范围内分布 的数据占总体的 9名，在 X+3SD 范围内分布的数据占总体的 99%。当我们要求 检验结果在 X+2SD 范围内为合 格时，将有 95包的数据可能合格- 5.1.4 真值 用确切的、最理想的决定性方法测得的值, 称为真值。真值一般是测不到的。 通过可靠的决定性方法测出的值，称为靶值，通常用靶值来 表示真值的大小。 5.1.5 准确度 (accuracy) 是指测定结果与真值 (或靶值) 接近的程度。准确度不能以数字表示，往往 用不准确度来衡量。测定结果与坡值的偏离程度称为偏差，它 表示该项检验的 不准确度。 绝对偏差=检验的均值-真值〈或靶值 相对偏差=绝对偏差真值> 〈或丢值) x100% 5.1.6 精密度 Precision 是指对同一样本重复测定时，每次测定结果与平均值的接近程度, 即重复测 定值之问的符合程度 5.1.7 标准品 1、国际标准品由 WHO 或相应组织标定的，用肯定的、公认的、准确的物理或 化学方法测定的定值材料。 2、国际生物学活性标准品根据生物学反应由 WHO 或相应组织标定的国际活性 单位的材料。 3、参考标准血清国家标准化组织根据国际标准化生产的法定材料。可用于鉴定 仪器和鉴定方法准确性- 5.1.8 临床决定性水平 〈clinical decision leuel) 当某个被测物的浓度达到某一水平时,临床医师必须采用医疗措施。 被测物 的这浓度称为临床决定性水平。 5.2 质量控制血清 质控血清是已有靶值的血清, 在每次的常规检验中加入一份或数份, 通过所 得结果来了解本次检验的情况。质控血清检验的结果如能控制 其误差在一定范 围内， 就说明该检验没有发生不允许的误差。如果出现超过允许误差范围的异常 结果，提示该检验不合格，应寻找原因， 纠正后，重检符测标本。因此质控血 清在质控工作中起重要作用。 5.2.1 质控血清的使用 卫生部临床检验中心制备的乙肝标志物质控血清, 可以在 -20C保持半年定 值不变。冰冻状态融化使用时，应先混匀，未用完部分可在 4C保存5 天。不宜 反复冰融或自行分装。开展某项检验 的室内质控工作需要的质控血清，一般按 3-6 个月用量准备。自制的不定值质控血清，在一批质控血清将用完之前，需准 备下一批质控 血清。质控血清要求性能稳定，较长期内效价不变，其理化性质  应与病人样本相近，这样才能有效地起到监测作用。 5.2.2 临界值质控血清 质控制血清分定值和未定值两种。如只用一份质控血清定值，一般定在正常 值与异常值交界点上，定性测定时处于弱阳性水平，称为临界 值。乙肝标志物 临界值的制定，应按临床要求，为临床提供统一的判断弱阳性的标准。临界值质 控血清可以作为试剂盒中的阳性对照品和 阴性对照品以外的第三个对照品，它 可以灵敏地反映出试剂盒的检出水平，确保弱阳性反应的标本不漏检。 5.2.3 质控血清的制备 每个实验室可以根据自己的条件,， 选用临床中心提供的质控血清,或按以下 方法自己制备 本室使用的质控血清〈以乙肝质控血清为例)。 1) 收集新鲜的无溶血、无黄掏、无细菌污染的阳性血清。 2) 56C加热 10 小时来活。 3) 离心或过滤除去沉淀。 4) 用 10%的小牛血清或正常人血清 〈PBS 缓冲液) 将收集的血清稀释至所需 的浓度。如能用正常的人血清稀释更好，因其成份更接近于检测标本。 5) 抽滤除菌。按一次使用的基分装小安语，封口，20忆保存各用。不可反复并 融。 被检物要求检出的水平常被认为是质控血清应选择的水平。 如果该试验还有 其它要求，则应加所要求浓度的质控物。 6) 标定售量。20-30 次测定结果删除>+2SD 数据的均值作为革值，并与已知定 值血清对比测定- 5.3 室内质量控制程序 临床检验的检测结果, 每次或每天之间不可能没有误差。 决定允许的误差范 围，以临床上不造成误诊与漏诊为准，通过以下步骤来确定质 控范围。 1) 最佳条件下的测定误差。 2) 已知值的血清在常规检验条件下的误差。 3) 未知值的血清在常规检验条件下的误差。 4) 临床应用的要求。对任何一个试验都应确定一个允许的误差范围，前题是满 足临床要求。如允许误差定得过小，在临床上不存在任何意义 ，但为了符合该 规定却要花费很大人力、物力和时间。 相反，如果将允许误差定得过大，将使临 测系统察觉不到临床上要求检出的误差， 失去质控的意义。 5.3.1 最佳条件下已知值质控血清变异 (optimal conditions variance,简称 OCV) 的测定在本实验室最佳条件下【包括操作者、试剂、仪器等) 检测质控血清 20-30 次，测得结果计算，求出该组数据的均值和标准差 《SD) 表示该实验室的最佳 工作质量。 现举例说明 HBsAg ELISA 法检测时 OCYV 的测定。使用的质控制血清为临 界血清，HBsAg 浓度为 Sng/ml。在该实验室中选择素质最好、拘作 最熟练的技 术员进行认真地专门测定，选用最佳的试剂使，检测之前，将恒箱、加样器等认 真校正、调校正、调试，使用新的加样吸头等 ，即在最佳、最理想的条件下进 行检测。除质控血清外同时测定阴性对照唱和阳性对照品。并作双份测定，得出 2 个吸光值 (A 值)，求 出X。连续作 20 次，求出 20 个X，即 X1.……X20。从 这 20 个数据中，求出OCY 的X和SD。 5.3.2 党规条件下已知值质控血清变异 (routine conditions variance-known value, 简称 RCVK) 的测定。 做常规检验的技术人员，在常规检验的条件下，将质控血  清放在常规检测样本中，进行 20 次检验，结果计算同 OCV 法。一般认为 RCV 的SD 在 OCYV 的 SD 两倍范围内可以接受。若太大应该查找原因，使其向 OCV 的 SD 值靠近。在改进实验宇条件后〈例如较正加样器，纠正洗板操作，调正温 育温度等)，重新进行 RCVK 的测定。如果 RCVK 的 S D 值更小，说明 OCY 不 是最佳条件下测定的, 应重新再测 OCV.。 常规条件下, RCVK 肯定要比 OCV 大。 通过质控控制各项条件， 使 RCVK 的数据尽可能接近 OCYV 值。RCVK 的数据 反映该实验室日常工作的质