牛血清白蛋白与核黄素荧光共振能量 毕业论文.doc

牛血清白蛋白与核黄素荧光共振能量 摘要：本文采用荧光光谱法尝试在弱碱性溶液中以BSA为给体，核黄素为受体，研究BSA与核黄素荧光共振能量转移情况。考察了缓冲溶液体系、BSA的浓度、反应时间等多种因素的影响。实验结果表明，在80μL pH 7.43的Tris-HCl 缓冲液中，反应时间为8min，6.9×10-7mol/L CTMAB，核黄素的浓度为1.2×10-6～1.2×10-5mol/L范围时，其线性回归方程Fa/Fd =0.0863+0.0884C (10-6 mol/L)，相关指数和检测限分别为0.9973和2.6×10-8mol/L。该方法灵敏度高，为核黄素的测定提供了新的方法。 关键词: 牛血清白蛋白; 核黄素; 荧光共振能量转移 绪论 血清白蛋白是人和动物血清中含量最丰富的一种蛋白质，与各种带正负电荷的物质及电中性物质均有一定程度的相互作用。各种药物进入体内首先与血清白蛋白结合，通过血浆的存储和运输，到达受体部位产生药理作用[1]。测定血清白蛋白的变化，可为疾病诊断、疗效观察提供有价值的资料及数据。因此，从不同角度研究以白蛋白为代表的蛋白质与具有生物活性小分子间的相互作用，对了解药物的作用机制具有重要意义。通过对荧光光谱的研究，可以获得蛋白质分子中荧光生色基团的种类、结构和所处微环境及其分布情况等有用信息，同时还可以得到外源物质与生物大分子相互作用的有关数据。目前已有多篇文献采用荧光光谱法研究药物分子如槲皮素[3]甲基硫菌灵[4]等与血清白蛋白的相互作用。 核黄素(Riboflavin, RI)又称维生素B2，是人体必需的13种维生素之一，具有促进发育和细胞的再生；促使皮肤、指甲、毛发的正常生长；消除口腔内、唇、舌的炎症；减轻眼睛的疲劳增进视力，协助代谢碳水化合物、脂肪、蛋白质等多种功能。同时还具有利尿消肿防治肿瘤，降低心脑血管病的发生等保健功效。 荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy　transfer，FRET)是一种非辐射能量跃迁，通过分子间的电偶极相互作用，将给体激发态能量转移到受体激发态的过程。发生FRET需要几个条件：供受体在空间上比较接近(1～10nm)；供体的荧光量子产率较高；供体的发射光谱与受体的吸收光谱要重叠;供、受体的发射光谱要足够分开[5, 6]。目前，荧光共振能量转移技术已应用于无机离子的测定[7,8]，维生素的测定[9,10]，蛋白质分析[11]以及作为核酸荧光探针的研究等诸多领域。本文采用荧光光谱法尝试在弱碱性溶液中以BSA为给体，核黄素为受体，研究BSA和核黄素荧光共振能量转移情况。 1 实验部分 1.1 仪器和试剂 F-4500型荧光分光光度计（日本日立公司, 配有R3896型红敏光电倍增管10mm标准石英池）；PHS-3CT型精密酸度计（上海大普仪器有限公司）；牛血清白蛋白(Amresco. 0930, 分子量: 67000)；核黄素(中国药品生物制品检定所)，pH = 7.43的Tris--HCl 缓冲溶液，配制1. 0×10-4mol/L 的BSA 标准溶液，6.0×10-4mol/L核黄素标准溶液，两种标准溶液均在0～4℃冰箱中保存。实验所需浓度由此稀释而得。Tris，HCl，NaCl均为分析纯；水为双重蒸馏水。 1.2 实验方法 在10mL比色管中加入80μL pH=7.43的Tris-HCl缓冲溶液，60μL浓度为1.15×10-4 mol/L CTMAB溶液，100μL 浓度为1.0×10-4mol/L BSA，一定浓度的核黄素溶液，定容到10mL，放置8min，在荧光分光光度计上，以295nm为激发波长，测定Fa 和Fd，计算Fa/Fd，做标准工作曲线。 2 结果与讨论 2.1 FRET的构建 BSA与核黄素的荧光能量转移的首要条件就是给体的发射光谱和受体的吸收光谱要有相当程度的重叠[12]。在实验条件下，BSA的荧光峰 ( 350 nm)与VB2的吸收峰 ( 375nm)有较好的重叠。这样就为BSA和VB2的能量转移提供了前提条件。用波长为295nm去激发BSA和VB2的混合体系，既可以保证BSA有较大的发射，而VB2又不会被激发，使能量转移效果好。实验中观察到，在混合体系中，给体在295nm处的荧光峰比单独存在时明显下降，而VB2的荧光峰比单独存在时明显增强，这充分说明了在这两种物质间确实发生了荧光能量转移 (图1)。加入NaCl溶液时对于体系，BSA荧光强度减小不明显，VB2 的荧光强度增大不明显，说明离子强度对体系影响不明显；加入CTMAB时BSA荧光强度减小明显，VB2 的荧光强度增大明显，且荧光峰位均没有变化，也就是说CTMAB对体系荧光共振能量转移的影响明显。
图 1　BSA-VB2荧光共振能量转移光谱图 1: BSA, 2: VB2, 3: BSA+VB2, 4: BSA+VB2+NaCl, 5: BSA+VB2+CTMAB 2.2 影响FRET的主要因素 2.2.1 考察酸度对体系的影响. 在激发波长为295 nm条件下，测定了不同pH的缓冲溶液对荧光强度的影响。由实验结果发现，在BSA和VB2的浓度分别为2.0×10-6mol/L和1.2×10-5mol/L的条件下，pH 值为7.43，用量为80μL时Fa/Fd最大，所以本实验选用Tris-HCl缓冲溶液的pH值为7.43，用量为80μL，见图2和图3。
图2 PH值的影响
图3 缓冲溶液浓度的影响 2.2.2 考察CTMAB浓度对FRET体系的影响 在激发波长为295nm条件下，测定了不同浓度的CTMAB对荧光强度的影响，实验结果发现用6.9×10-7mol/L的CTMAB时Fa/Fd最大，所以本实验的最佳CTMAB的浓度为6.9 ×10-7mol/L，见图4。
图4 CTMAB浓度的影响 BSA: 2.0×10-6 mol/L; VB2: 1.2×10-5mol /L; Tris-HCl: 80μL pH =7.43 2.2.3 考察时间对FRET体系的影响 以激发波长为295 nm的波长激发，BSA和 VB2的浓度分别为2.0×10-6mol/L和1.2×10-5mol/L的条件下，测定不同时间对体系的影响，经实验发现在实验反应8min 时Fa/Fd最大（图5），所以本实验选用的反应时间为8min。
图5 反应时间对FRET的影响 　BSA: 2.0×10-6 mol/L; VB2: 1.2×10-5mol/L; CTMAB: 6.9×10-7mol/L; Tris-HCl: 80μL; pH =7.43 2.2.4 考察BSA浓度对FRET体系的影响 在10 mL比色管中加入80μL pH=7.43的 Tris-HCl 缓冲溶液，60μL浓度为1.15×10-4 mol/L的CTMAB溶液，200μL浓度6.0×10-4mol/L的VB2，一定量的BSA溶液，定容到10mL，放置8min，在荧光分光光度计上，以激发波295nm测Fa和Fd，如图6所示，实验数据表明当BSA的浓度增大时，VB2 的荧光强度逐渐增强，说明在BSA与VB2 之间确实发生了共振能量转移；当BSA的浓度大于1.0×10-6 mol/L时继续增大BSA的浓度对VB2 的荧光强度没有明显的效果。因此本文的BSA的浓度为1.0×10-6 mol/L。
图6 BSA浓度的影响 From1 to 10, the concentration of BSA was 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2.0×10-6mol/L, VB2: 1.2×10-5mol/L, CTMAB: 6.9×10-6 mol/L, PH=7.43. 2.2.5 考察VB2浓度对FRET体系的影响 在10 mL比色管中加入80μL pH=7.43的Tris-HCl 缓冲溶液，60μL浓度为1.15×10-4 mol/L CTMAB溶液，100μL浓度1.0×10-4mol/L核黄素，一定量的核黄素溶液，定容到10mL，放置8min，以激发波长295nm测Fa和Fd，如图8所示。当VB2 的浓度由1.2×10-6 mol/L逐渐增大到1.2×10-5 mol/L时BSA的荧光强度逐渐降低，核黄素VB2 的荧光强度逐渐增大，也就是说随着VB2 的浓度逐渐增大，给体和受体间的能量转移效率不断提高，且Fa/Fd与VB2 的浓度之间存在良好的线性关系（图8）。
图7 VB2浓度的影响 From 1 to 10, the concentration of VB2 was 1.2, 2.4, 3.6, 4.8, 6.0, 7.2, 8.4, 10.8, 12.0×10-5mol/L, BSA: 1.0×10-6 mol/L, CTMAB: 6.9×10-6 mol/L, PH=7.43.
图8 工作曲线 2.2.6 牛血清白蛋白周围VB2分子数目的确定 设1个牛血清白蛋白 (给体，用D表示)可同时与n个VB2 (受体，用A表示)分子发生有效的荧光共振能量转移，则它们之间的关系可表示为：D＋nA ＝Dan，若固定牛血清白蛋白的浓度，改变VB2的浓度，随着VB2浓度的增加，由于荧光共振能量转移，牛血清白蛋白的荧光强度不断降低，而的荧光强VB2 浓度不断增强。当这种此消彼涨的变化进行到一定程度后，若VB2继续增加的浓度，由于“配位”饱和，则牛血清白蛋白和VB2的荧光强度不再发生明显的改变。以荧光强度为纵坐标，VB2和牛血清白蛋白的浓度之比为横坐标作图，采用两边切线外推，交点