常用蛋白标签

重组蛋白表达技术现已经广泛应用于生物学各个具体领域特别是体内功能研究和蛋白质的大规模生产都需要应用重组蛋白表达载体美国GeneCopoeia的蛋白表达载体按照表达宿主的不同新推出3类分别为表达宿主为大肠杆菌哺乳动物细胞的以及慢病毒载体宿主可以为哺乳动物细胞和原代细胞除了必要的复制和筛选的元件协助表达和翻译的元件外本文将各类载体分别按照功能标签的不同确定种类并将个标签的功能初步介绍如下His6His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签可插入在目的蛋白的C末端或N末端当某一个标签的使用一是能构成表位利于纯化和检测二是构成独特的结构特征结合配体利于纯化组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力可用于固定化金属螯合层析IMAC对重组蛋白进行分离纯化使用Histag有下面优点1标签的分子量小只有084KD而GST和蛋白A分别为26KD和30KD一般不影响目标蛋白的功能2His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用后者在纯化包涵体蛋白时特别有用用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和亲和层析去除杂蛋白使复性不受其它蛋白的干扰或进行金属螯和亲和层析复性3His标签融合蛋白也被用于蛋白质蛋白质蛋白质DNA相互作用研究4His标签免疫原性相对较低可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫制备抗体5可应用于多种表达系统纯化的条件温和6可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签FlagFlag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽DYKDDDDK同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高FLAG作为标签蛋白其融合表达目的蛋白后具有以下优点1FLAG作为融合表达标签其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能性质这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究2融合FLAG的目的蛋白可以直接通过FLAG进行亲和层析此层析为非变性纯化可以纯化有活性的融合蛋白并且纯化效率高3FLAG作为标签蛋白其可以被抗FLAG的抗体识别这样就方便通过WesternBlotELISA等方法对含有FLAG的融合蛋白进行检测鉴定4融合在N端的FLAG其可以被肠激酶切除DDDK从而得到特异的目的蛋白因此现FLAG标签已广泛的应用于蛋白表达纯化鉴定功能研究及其蛋白相互作用等相关领域MBPMBP麦芽糖结合蛋白标签蛋白大小为40kDa由大肠杆菌K12的malE基因编码MBP可增加在细菌中过量表达的融合蛋白的溶解性尤其是真核蛋白MBP标签可通过免疫分析很方便地检测有必要用位点专一的蛋白酶切割标签如果蛋白在细菌中表达MBP可以融合在蛋白的N端或C端纯化融合蛋白可通过交联淀粉亲和层析一步纯化结合的融合蛋白可用10mM麦芽糖在生理缓冲液中进行洗脱结合亲和力在微摩尔范围一些融合蛋白在02TritonX100或025Tween20存在下不能有效结合而其他融合蛋白则不受影响缓冲条件为pH70到85盐浓度可高达1M但不能使用变性剂如果要去除MBP融合部分可用位点特异性蛋白酶切除检测可用MBP抗体或表达的目的蛋白特异性抗体检测GSTGST谷胱甘肽巯基转移酶标签蛋白本身是一个在解毒过程中起到重要作用的转移酶它的天然大小为26KD将它应用在原核表达的原因大致有两个一个是因为它是一个高度可溶的蛋白希望可以利用它增加外源蛋白的可溶性另一个是它可以在大肠杆菌中大量表达起到提高表达量的作用GST融合表达系统广泛应用于各种融合蛋白的表达可以在大肠杆菌和酵母菌等宿主细胞中表达结合的融合蛋白在非变性条件下用10mM还原型谷胱甘肽洗脱在大多数情况下融合蛋白在水溶液中是可溶的并形成二体GST标签可用酶学分析或免疫分析很方便的检测标签有助于保护重组蛋白免受胞外蛋白酶的降解并提高其稳定性在大多数情况下GST融合蛋白是完全或部分可溶的纯化该表达系统表达的GST标签蛋白可直接从细菌裂解液中利用含有还原型谷胱甘肽琼脂糖凝胶Glutathionesepharose亲和树脂进行纯化GST标签蛋白可在温和非变性条件下洗脱因此保留了蛋白的抗原性和生物活性GST在变性条件下会失去对谷胱甘肽树脂的结合能力因此不能在纯化缓冲液中加入强变性剂如盐酸胍或尿素等如果要去除GST融合部分可用位点特异性蛋白酶切除检测可用GST抗体或表达的目的蛋白特异性抗体检测HAHA标签蛋白标签序列YPYDVPDYA源于流感病毒的红细胞凝集素表面抗原决定簇9个氨基酸对外源靶蛋白的空间结构影响小容易构建成标签蛋白融合到N端或者C端易于用AntiHA抗体检测和ELISA检测cMycCMyc标签蛋白是一个含11个氨基酸的小标签标签序列GluGlnLysLeuIleSerGluGluAspLeu这11个氨基酸作为抗原表位表达在不同的蛋白质框架中仍可识别其相应抗体CMyctag已成功应用在Westernblot杂交技术免疫沉淀和流式细胞计量术中可用于检测重组蛋白质在靶细胞中的表达eGFPeCFPeYFPmCherry分别是增强型绿色荧光蛋白增强型黄绿色荧光蛋白增强型黄绿色荧光蛋白单体红色荧光蛋白具有不同的激发波长发射波长为均由野生型荧光蛋白通过氨基酸突变和密码子优化而来就eGFP而言相对于GFP其荧光强度更强荧光性质更稳定同时载体中构建的Kozak序列使得含有eGFP的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高mCherry是从DsRed演化来的性能最好的一个单体红色荧光蛋白可以和GFP系列荧光蛋白共用实现多色标记体内外实验表明mCherry在N端和C端融合外源蛋白时荧光蛋白活性和被融合的目标蛋白功能相互没有明显影响这些荧光标签蛋白其融合表达目的蛋白后具有以下优点1不用破碎组织细胞和不加任何底物直接通过荧光显微镜就能在活细胞中发出绿色荧光实时显示目的基因的表达情况而且荧光性质稳定被誉为活细胞探针2其自发荧光不需用目的基因的抗体或原位杂交技术就可推知目的基因在细胞中的定位等情况3同时细胞内的其它产物不会干扰标签蛋白检测从而使其检测更显得快速简便灵敏度高而且重现性4其低消耗高灵敏度检测十分适用于高通量的药物筛选因此现eGFP表达标签被广泛地应用于基团表达调控转基因功能研究蛋白在细胞中的功能定位迁移变化及药物筛选等方面5mCherry红色荧光蛋白在标记病毒颗粒研究病毒和宿主细胞之间更有得天独厚的优势如用mRFP或mCherry标记HIV病毒颗粒研究H1V和宿主细胞问的相互作用以及HIV侵染宿主细胞的过程用mRFP标记慢病毒颗粒研究慢病毒在小鼠体内的复制过程等荧光素酶来源于生物体内的荧光素常见的有萤火虫荧光素酶海肾荧光素酶和Guassia荧光素酶这些荧光素酶作为报告蛋白被用于分子生物学研究中这种技术被称为报告基因检测法或萤光素酶检测法LuciferaseAssay跟普通融合蛋白标签不同使用荧光素酶构建的报告基因可用作目的基因的定量分析因此常用于研究启动子miRNA3UTR克隆的功能与调控因为它们对目的基因的调控可以是渐变的而不是简单的开和关两种状态优点灵敏度高检测幅度宽不是哺乳动物细胞内源性基因重复性好与HTS兼容等萤火虫和海肾荧光素酶已经被广泛应用于协同报告并进行均一化研究由于它们都是快速容易和高灵敏的监测方法而且萤火虫和海肾荧光素酶是理想的双基因报告系统因为它们来源于不同的生物进化方向蛋白结构和底物差异都很大在实验中不会产生相互影响基于荧光素酶的特性我司研发提供的SecretePairDualLuminescenceAssayKit可用于分析双报告系统中Gaussia荧光素酶GLuc和分泌型碱性磷酸酶SEAP活性GLuc和SEAP均为分泌型报告蛋白无需裂解细胞即可便捷的从细胞培养液中取得样本并对实验结果进行精准的实时分析AviTagAviTag标签蛋白是一个15个氨基酸的短肽具有一个单生物素化赖氨酸位点与已知天然可生物素化序列完全不同可以加在目标蛋白的N端和C端融合表达后可被生物素连接酶生物素化为了纯化重组蛋白选用低亲和性的单体抗生物素蛋白或抗生物素蛋白衍生物除了用于蛋白质分离纯化还用于蛋白质相互作用研究AviTag标签系统具有以下几大优点1无论在体外或者体内几乎所有的蛋白都可以在一个独特的AviTag位点轻易且有效地被生物素化2生物素化是通过酶和底物的反应来实现反应条件相当温和而且标记的专一性极高3生物素AviTag只有15个氨基酸对蛋白空间结构的影响非常小SNAPTagSNAPTag是新一代的蛋白标签技术不仅专一性极高而且稳定最大的优点是适用于多种环境下的蛋白质检测与纯化如活细胞内溶液中或固态相如SDSPAGEgels等SNAPTag是从人的O6甲基鸟嘌呤DNA甲基转移O6alkylguanineDNAalkyltransferase获得无论体内还是体外SNAPTag都能与底物高特异性地共价结合使蛋白标记上生物素或荧光基团如荧光素和若丹明SNAP所带的活性巯基位点接受了苯甲基鸟嘌呤所携带的侧链苯甲基基团释放出了鸟嘌呤这种新的硫醚键共价结合使SNAP所带的目的蛋白携带上了苯甲基基团所带的标记物苯甲基鸟嘌呤在生化条件下稳定并且没有其他蛋白会和这类物质作用所以SNAP标签反应是高特异的检测生物素或各种颜色荧光的底物如荧光素若丹明可渗透进入细胞方便快捷地进行活细胞内SNAPTag融合蛋白的标记与检测它们也可特异性地标记大肠杆菌酵母和哺乳动物等细胞抽提液或已经纯化的蛋白液中的SNAPtag融合蛋白将纯化的或未纯化的SNAPTag融合蛋白与表面固定了苯甲基鸟嘌呤的基质混合蛋白即可特异与底物作用形成共价键融合蛋白间接被固定在了基质表面上可以达到更方便快捷地研究蛋白功能或纯化蛋白的目的HaloTagHaloTag标签蛋白是一种脱卤素酶的遗传修饰衍生物可与多种合成的HaloTag配基有效地共价结合这个分子量为33KDa的单体蛋白能融合在重组蛋白的N端或C端并在原核和真核系统中表达HaloTag配基是小分子化学物能够在体外或体内与HaloTag蛋白共价结合这些配基由两个关键组分组成1一个通用的HaloTag反应联结子结合HaloTag蛋白2一个功能基团例如荧光染料或亲和媒介能够共价和特异性结合多种合成的报告基团和亲和配基的特性使得HaloTag蛋白能够用于检测和亲和结合或固相化固定目的蛋白SUMOSUMO标签蛋白是一种小分子泛素样修饰蛋白Smallubiquitinlikemodifier是泛素ubiquitin类多肽链超家族的重要成员之一在一级结构上SUMO与泛素只有18的同源性然而两者的三级结构及其生物学功能却十分相似研究发现SUMO可以作为重组蛋白表达的融合标签和分子伴侣不但可以进一步提高融合蛋白的表达量且具有抗蛋白酶水解以及促进靶蛋白正确折叠提高重组蛋白可溶性等功能此外SUMO还有一项重要的应用就是可用于完整地切除标签蛋白得到天然蛋白因为SUMO蛋白水解酶我公司可提供能识别完整的SUMO标签蛋白序列并能高效地把SUMO从融合蛋白上切割下来切除SUMO后经过亲和层析去除标签蛋白部分就得到和天然蛋白一样的重组蛋白所以SUMO标签也常用于和其他标签一起应用作为特异酶切水解位点