生物工程毕业论文-胚胎干细胞研究进展及应用.doc

胚胎干细胞研究进展及应用 摘要：近年来胚胎干细胞的研究与应用几乎涉及到所有生命科学和生物医学领域，成为当前生物工程的核心领域之一。本文通过文献法等研究方法，收集整理了近年来涉及胚胎干细胞的研究进展及应用的一些热点问题。研究的范围主要有胚胎干细胞的概念、生理特点；胚胎干细胞的分离、培养；胚胎干细胞在基础研究及临床应用方面的进展，胚胎干细胞在一些领域中的研发方向；制约胚胎干细胞研究与应用的一些瓶颈问题等。通过对上述信息资料的遴选、归纳与研究，旨在抓住该领域的关键问题，为毕业后的教学及相关研究打下坚实的基础。 关键词： 胚胎干细胞；进展；应用； Advance and Application In Study of Embryonic Stem Cells Abstract：As one of hot and core issues in bioengineering， the application and study of embryonic stem cells has nearly involved in all the research fields on life science and biomedicine in recent years. The latest progresses in study and application relating to embryonic stem cells are collected and packed up in this article. The scope of study on this paper mainly includes its definition， physiological characteristics， isolation， culture， actual application and impediment in basic research and clinical practice. The prospects of embryonic stem cells are also discussed. We choose the above-mentioned points to discuss and study because we have the goal that will teach and work better on this field in future. Key words： embryonic stem cell； advance ； application；  目 录 一、引言……………………………………………………………………………………1. 二、胚胎干细胞及其生理特点……………………………………………………………2. 三、胚胎干细胞的分离、培养极其研究与进展………………………………………2. (一)．细胞株系的建立及发展状况…………………………………………………… 2. (二)．胚胎干细胞的分离、培养及发展状况……………………………………………3. (三)．胚胎干细胞的分子标记及其鉴定…………………………………………………4. (四)．胚胎干细胞的诱导分化……………………………………………………………5. 四、胚胎干细胞的应用及前景……………………………………………………………5. (一)．揭示人和动物的个体发育机制及影响因素………………………………………5. (二)．用于生理、药理、病理和毒理等方面的研究……………………………………5. (三)．用于细胞移植治疗和器官移植……………………………………………………6. (四)．用于解决免疫排斥问题与基因治疗………………………………………………6. (五)．生产克隆动物和转基因动物……………………………………………………7. 五、制约胚胎干细胞研究与应用的一些瓶颈问题……………………………………7. (一)．科学与社会伦理的冲突…………………………………………………………7. (二)．胚胎干细胞的定向分化及分化细胞的分离纯化…………………………………7. (三)．胚胎干细胞移植治疗鲜有成功案例………………………………………………8. (四)．胚胎干细胞移植的安全性问题……………………………………………………8. 参考文献：…………………………………………………………………………………8.  胚胎干细胞研究进展及应用 一、引言 著名的生物学家E.B Wilson曾经说过：“所有生物学的答案最终都要到细胞中去寻找，因为所有生物体都是，或曾经是一个细胞”。1999年，有关干细胞的研究被Science杂志评为1999年度十大科学进展之首；2000年12月干细胞研究再次被Science杂志评为该年度世界十大科学成就之一。胚胎干细胞作为最佳的“种子”细胞，有着其它干细胞及体细胞无法比拟的生理生化特点，展现着迷人的应用前景，是该研究领域中的核心课题。本文对近年来胚胎干细胞的研究进展及应用方面的一些焦点、热点问题进行了遴选、归纳与研究，现综述如下。 二、胚胎干细胞及其生理特点 胚胎干细胞简称ES细胞（embryonic stem cell）或EK细胞（Evans和Kaufman）。胚胎干细胞（Embryonic stem cell，ES）是指从附植前早期胚胎内细胞团（ICM）或附植后胚胎原始生殖细胞（PGCs）分离出来的一种具有无限增殖能力和全方向分化能力的干细胞[1]。胚胎干细胞具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的生理特性。 无限增殖是指，经体外抑制培养，来自内细胞团的胚胎干细胞可以保持旺盛的分裂能力且维持不分化状态。例如，在一项胚胎干细胞的培养实验中，Sudat将小鼠ES细胞传至250代以上，这些传代细胞仍具有正常的二倍体核型，因此ES细胞就轻易突破了细胞传代培养中50次幂的瓶颈，而具有“不死性”。利用ES细胞具有不断增殖的能力的特点，在体外培养条件下可以建立稳定的干细胞系，并保持发育的潜能性。 自我更新是指在长期培养中，胚胎干细胞能够维持自己的多向分化的特性，且不会随着分裂传代而丧失，这是一个胚胎干细胞系所必须具有的特征，例如，ES细胞在饲养层细胞上，或在添加抑制因子的培养液中，能够维持不分化的状态。 多向分化是指胚胎干细胞可以分化成各种不同的细胞类型并参与到发育过程中，一个基本的标准是胚胎干细胞具有向三个胚层分化的能力，例如：在培养液中加入分化诱导因子，如牛黄酸、丁酰环腺苷酸等化学物质时，就可以诱导ES细胞和不同类型的组织细胞分化；又如ES 细胞在含有白血病抑制因子(LIF)和维生素A 酸(RA) 的培养基上，可以分化形成全壁内胚层；将ES 细胞与胚胎细胞共同培养或将ES 细胞注入囊胚腔中，ES 细胞就会参与多种组织的发育。由于个体的所有细胞都是由内细胞团发育而来，所以胚胎干细胞理论上可以诱导分化为机体中200多种细胞。 ES细胞具有与早期胚胎细胞相似的形态结构，体积小、细胞核大、核仁明显、胞核中多为常染色质、胞质胞浆少、结构简单。体外培养时，细胞排列紧密，呈集落状生长。用碱性磷酸酶染色，ES细胞呈棕红色，而周围的成纤维细胞呈淡黄色。 三、胚胎干细胞的分离、培养极其研究与进展 目前ES细胞的分离、培养体系的研究不仅是胚胎工程的前沿课题之一，也是当前生命科学的热门课题之一。胚胎干细胞的研究、实践和应用历程，是科学工作者辛勤劳作和智慧的结晶，是科学的继承性和创新性相统一的结果。ES细胞的研究可追溯到上世纪五十年代，由于畸胎瘤干细胞（EC细胞）的发现开始了ES细胞的生物学研究历程。 （一）.细胞株系的建立及发展状况 1981年Evans和Kaufman以手术切除受精后2.5 天小鼠卵巢并结合激素注射干扰子宫环境，从而使胚胎延迟着床，首次成功分离得到小鼠ES细胞。 同年，Martin G R以免疫外科法剥离小鼠囊胚滋养层细胞，得到内细胞团(ICM)并将其置于STO细胞饲养层上，培养基为小鼠PSA-1 ES细胞条件培养基，结果也得到小鼠ES细胞。 后来，Dhhaise用小鼠8-细胞胚胎消化成的单个分裂球在小鼠原代成纤维细胞饲养层上，建立了一个胚胎干细胞系MSB1。将MSB1注入SCID(severe combined immunodeficient mice)小鼠，能产生包含三胚层分化物的畸胎瘤；将MSB1注入囊胚产生了2个活的嵌合体小鼠(1雄，1雌)。上述结果表明，小鼠胚胎干细胞的分离不必仅由囊胚内细胞团得到，只用早期胚胎的单个细胞即可以实现。 1995年，Thomson等从恒河猴的囊胚中成功分离出胚胎干细胞，建立了第一个灵长类动物的胚胎干细胞株； 1998年，Thomson等建立了第一株人类胚胎干细胞（hES细胞株）； 1998年，Shamblott等建立了第一株人类生殖干细胞（hEG细胞株）； 2002年3月，美国麻省理工学院的科学家宣布，他们首次利用人体胚胎干细胞培育出毛细血管，展示了胚胎干细胞技术在治疗心血管疾病等领域的应用潜力。 2007年美国科学家罗伯特·兰扎等利用在试管受精后的人类胚胎产生了两个干细胞株。采用这种特殊的技术，每次从胚胎中只提取单一细胞，不影响胚胎的正常发育，即可以发育成正常的婴儿，并且提取的单个细胞还能够培育成为干细胞链。这样，在不破坏胚胎的情况下，得到用于疾病治疗的干细胞株，有助于解决胚胎干细胞研究与应用过程中所发生的社会伦理问题，既有利于疾病的治疗，又可能为某个体终生保留自身的干细胞株。 （二）. 胚胎干细胞的分离、培养及发展状况 小鼠胚胎干细胞体外分离及培养条件的探索为人类胚胎干细胞的研究提供了丰富的经验。目前hES、hEG细胞分离基本采用了免疫外科分离方法，从囊胚分离内细胞团（inner cell mass，ICM），在无Ca2+、Mg2+的培养液中将分离出的ICM置于饲养层细胞上(feeder cell)，饲养细胞多为经过照射，不能进行有丝分裂的鼠成纤维细胞，这样做是为了保证胚胎干细胞在饲养层细胞的支持下能够不断增殖，又能使胚胎干细胞与饲养层细胞形成明晰的区分界面。近年来亦有用研究者使用人成纤维细胞作为饲养层细胞获得成功的实例。 EG细胞的获得多采用机械研磨加酶消化的方法，将特定时期的胚胎细胞转至有饲养层细胞的培养条件中。 人和鼠胚胎干细胞体外培养维持不分化所需的细胞因子不同，mES、mEG细胞需要LIF存在，LIF与LIF受体与膜蛋白gp130受体形成的异质性受体二聚体结合，激活受体相关的JAK蛋白激酶，使受体及相关蛋白磷酸化，从而促进转录因子STAT3二聚体形成并转移至核内，通过它与DNA靶部位结合，控制分化基因的转录，促进自我复制。 实验证明，维持hES、hEG细胞不分化的因素不是LIF而是鼠胚胎成纤维细胞。但具体通过何种机制作用，目前尚不清楚。此外，hES、hEG细胞培养液中还需要成纤维细胞生长因子(fi-broblast growth factor)维持其生长，而mES、mEG细胞不需要。 目前，国内外研究人员已在仓鼠、大鼠、兔、猪、牛、绵羊、山羊、水貂、恒河猴、美洲长尾猴以及人类都分离获得了ES细胞，而且已经证明小鼠ES细胞可以分化为心肌细胞、造血细胞、卵黄囊细胞、骨髓细胞、平滑肌细胞、脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、内皮细胞、黑色素细胞、神经细胞、神经胶质细胞、少突胶质细胞、淋巴细胞、胰岛细胞、滋养层细胞等。现在已有报导人类ES细胞能在适当条件下可分化为滋养层细胞、神经细胞、神经胶质细胞、造血细胞、 心肌细胞、胰岛细胞、血管内皮细胞、肝细胞等。 自1998年以来，人们试图一直在寻找一种最佳的胚胎干细胞培养体系。最初Tomas用小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）做饲养层，在培养液中添加胎牛血清。这种培养方法可以将HESCs传至数百代而保持其自身性质和遗传学性状不变，因而是目前世界各地干细胞实验室常用的方法。但是此方法存在很多问题，主要是异源物质的可能污染和培养程序极为繁琐复杂，因此严重限制了人类胚胎干细胞的工程化研发及临床应用。 英国的研究人员提出利用人源性体细胞(hES)作饲养层建立一株无动物源性蛋白污染的细胞系，将有可能为今后临床治疗性的应用提供安全的来源。最近科学工作者利用人的骨髓间充质干细胞 (mes2 enchymal stem cells ，MSC)为饲养层细胞支持hES细胞的生长，实验证明经过13代的传代，细胞仍保持hES细胞未分化状态的人类胚胎干细胞特征。 尽管通过使用hES作为饲养层避免了异种蛋白的污染，但是由于饲养层的生长周期有限、制备繁琐，而且各批次细胞状态有差异，限制了hES细胞的大量扩增和稳定传代，另外也很难对在饲养层上培养的hES细胞进行分子操作，使得对hES细胞自我更新能力和全能性的分子机制等的研究受到限制。 目前，建立人类胚胎干细胞（HESCs）最佳培养体系的基本方向是无饲养层、无血清的培养[2]；例如，Melissa Carpenter等人在2001在Nature Biotechnology发表的文章中提出了以MEF的条件培养液作为添加成分，建立了hES细胞无饲养层培养体系。在这之后又有科学家提出了建立长期无饲养层，用以培养hES的胚胎体系，添加LIF，Fibronectin等基质，其中Fibronectin可以增加细胞与培养皿的黏附，并可通过其受体Integrin激活一系列信号途径调节细胞的活动，包括细胞的增殖、凋亡和分化等。 最近BD公司以无饲养层基质（Matrigel基质）为基础开发了一种更适合hESC生长的优化表面——Matrigel hESC-qualified Matrix，为hESC研究提供了必需的重复性和一致性 新近，Sigma-Aldrich公司推出了一种新型的干细胞培养基质：HyStem™ ，这是首个可定制的合成ECM（细胞外基质），能实现干细胞的3D培养。通过定制HyStem™ 平台，研究人员能控制生长因子、附着因子和ECM蛋白的掺入，水凝胶的硬度及细胞囊化等。由于HyStem是一种合成的基质，而不是生物提取物，所以研究人员能够精确控制细胞生活环境的组成。 另外，从分子水平阐明人类胚胎干细胞得以维持其全能性和自我更新能力的机制，以及相关细胞因子的作用机制、信号途径，也是胚胎干细胞研究发展的重要途径，这有助于从理论上引导我们开发最为优化且成分明确的培养体系，实现临床细胞移植治疗的目标。 （三）. 胚胎干细胞的分子标记及其鉴定 胚胎干细胞的鉴定包括ES细胞形态学鉴定、ES细胞生长行为鉴定及免疫学鉴定。 在形态学方面的主要鉴定指标在于，ES细胞体积小，细胞核大，核仁明显，核型稳定等；在细胞生长行为方面，ES细胞在体外抑制分化培养过程中，有集群生长的趋势。上述鉴定方法操作简单，容易掌握，属于细胞学鉴定范畴。 免疫学方法鉴定则是在分子水平更精细、更准确的鉴定方法，是当前成果频出的一个重要科研领域。胚胎细胞在发育的不同阶段，其细胞表面出现不同的抗原，又称分子标记。胚胎干细胞的分子标记特点是，在胚胎干细胞未分化状态下高度表达，一旦分化，基因迅速降调甚至关闭。这些标记物加上干细胞时期细胞内碱性磷酸酶、端粒酶的特异性高表达，可成为鉴定胚胎干细胞的依据。例如，2002年Jiang等的研究结果证实，小鼠胚胎干细胞的表达标志是产生Oct-4、Rex-1及SSEA-1， 在体外培养条件下小鼠胚胎干细胞所产生的免疫反应相同。 迄今为止，已发现人胚胎未分化多能干细胞表面有13种分子标记。目前对这些分子标记的了解程度、研究深度基本可归纳为以下两种情况:①分子标记物基因序列清楚，并已克隆，如基因库中NM-Sox2等；②只是应用抗体检测才能测得细胞表面抗原，其特征还需进一步了解，如SEA-3，SEA-4，RA-1-60，RA-1-81，RA-2-54，CTM-2等。 （四）．胚胎干细胞的诱导分化 在体外培养条件中如果不添加LIF，在缺乏成纤维细胞饲养层或培养皿中细胞增殖堆积时，hES、hEG细胞呈自然分化。目前已有报道，在培养皿中撤去成纤维细胞饲养层，hES、hEG细胞经过3～5天的培养，便分化形成胚体(embryo bodies)，胚体分化出的细胞类型可归纳为：属于外胚层的神经细胞、上皮细胞， 属于中胚层的造血细胞、横纹肌细胞、平滑肌细胞、心肌细胞、软骨细胞、上皮细胞和属于内胚层的胰岛细胞等。 体内研究表明，将mES细胞注入小鼠腹腔内，可形成含有三胚层组织的畸胎瘤，这种畸胎瘤细胞核型仍为二倍体，无恶性病变。将hES、hEG细胞注入免疫缺陷鼠皮下，可观察到含有人三胚层组织的畸胎瘤生长[3]。 由于对ES、EG细胞分化形成器官潜能的分子机制了解不多，虽然有神经细胞[4]、胰岛细胞、心肌细胞的诱导分化成功，但定向诱导分化仍然是当前需要解决的问题。这需要密切跟踪细胞分化的每一步骤，了解细胞终末分化之前经历的中间过程，通过对正常发育过程的了解，有于建立体外诱导细胞分化的多种条件。 四、胚胎干细胞的应用及前景 胚胎干细胞研究的科学价值在于其诱人的应用前景。1998年，Thomson和Gearhart分别用胚胎干细胞和胚胎生殖细胞建立了人的胚胎干细胞系，在体细胞与生殖细胞之间架起了桥梁，为研究胚胎干细胞的发育，在体外培养人体细胞和组织，利用ES细胞治疗疾病提供了广阔的发展前景。如果最终能够精确诱导和调控胚胎干细胞的分化与增殖，在下列领域中将发挥极其重要作用。 （一）．揭示人和动物的个体发育机制及影响因素 生命最大的奥秘便是人是如何从一个细胞发展为复杂得不可思议的生物体的。人胚胎干细胞的体外可操作性，提供了在细胞和分子水平上研究个体发育过程新途径。 自然状况下哺乳动物胚胎是在母体内孕育的，而且在母体子宫内进行生长发育，因此很难在动物体内连续动态地研究其早期胚胎发育、细胞组织分化及基因表达调控过程， 而体外培养胚胎干细胞，利用其具有发育的全能性、可操作性及无限增殖等特性，为发育生物学研究提供了良好的体外模型系统。随着分子生物学的发展，通过比较胚胎干细胞不同发育阶段的干细胞和分化细胞的基因转录和表达，可确定胚胎发育及细胞分化的分子机制、发现新基因。结合基因打靶技术，可发现不同基因在生命活动中的功能等。因此，人胚胎细胞系的建立及人胚胎干细胞研究，可以帮助我们更加深入有效地在细胞和分子水平上研究个体发育过程并有助于促进对人体胚胎发育细节的基础研究。 （二）.用于生理、药理、病理和毒理等方面的研究 胚胎干细胞有望在短期内成为高效新型药物的发现、筛选的重要研发介质并有可能构建出动物和人类疾病的模型，从而用来研究动物和人类疾病的发生机制和发展过程以便找到有效和持久的治疗方法。 目前用于药物筛选的细胞都来源于动物或癌细胞这样非正常的体细胞，而胚胎干细胞可以模拟体内细胞与组织间复杂的相互作用，经体外定向诱导，为人类提供各种组织类型的人体细胞。在候选药物对各种细胞的药理作用和毒性试验中，胚胎干细胞提供了在细胞水平上对新药的药理、药效、毒理及药物代谢方面等创新型研究手段，大大减少了药物检测所需动物的数量，降低了成本。 由于胚胎干细胞类似于早期胚胎的细胞，它们将有可能被用来揭示哪些药物干扰胎儿发育和引起出生缺陷。另外，由于这类细胞本质上可以无限量地产生人体细胞，它们将在发现稀有人蛋白的研究计划方面有所作为，也正因为如此，国际上许多制药公司、科研工作者都瞄准了这一重要的研究领域。 （三）．用于细胞移植治疗和器官移植 从理论上讲，任何涉及丧失正常细胞的疾病，都可以通过移植由胚胎干细胞分化而来的特异组织细胞来治疗。如可将hES体外诱导分化的心肌细胞导入心室壁，重建己梗死的心肌功能；应用体外分化的胰岛细胞治疗I型糖尿病；应用诱导分化的神经前体细胞治疗帕金森病；中风、心率不齐、视网膜、肝功能不齐，还有关节炎等细胞损伤或退行性病变，都有望用hES予以恢复或根治[5]。 1999年Horwitz等用骨髓间质干细胞（BMSC）治疗遗传性骨缺陷病，并取得了一定效果。2004年9月，意大利一名5岁、患有地中海贫血症的男孩卢卡，科学家通过从其弟弟的胎盘血中提取干细胞移植到卢卡身上，使其战胜病魔，完全治愈。有理由相信，专能干细胞或多能干细胞能够做到的事情，作为最佳“种子”细胞，全能干细胞，即胚胎干细胞，也完全能够做到而且会更有效，从而把细胞移植治疗提升到一个新水平。 将来可应用胚胎干细胞在体外形成的器官取代功能衰竭的体内器官，为器官移植提供重要的来源保障。如果这一设想能够实现，将