实验动物学笔记

实验动物是指经人工培育的遗传背景清楚对其携带微生物和寄生虫实行控制用于科学实验教学检定及药品生物制品生产的动物实验动物五项基本福利一提供适当的清洁饮水和食物使动物不受饥渴之苦二提供适当的栖息场所能舒适地休息和睡眠使动物不受困顿不适之苦三预防疾病和给患病动物及时诊治使动物不受疼痛伤病之苦四保证拥有良好的条件和处置包括安乐死使动物不受恐惧和精神上的痛苦五提供足够的空间适当的设施以及与同类动物伙伴在一起使动物能够自由表达正常的习性3Rs概念Reduction减少Replacement替代Refinement优化人源化的小鼠模型即对免疫缺陷小鼠品系进行人源细胞移植在小鼠体内重建人的细胞和组织生物体从外界摄取维持自身生命所必需的物质及其消化吸收和排泄过程称为营养动物自发地从外界寻求到的营养物质称为食物人类饲喂给动物的营养物质称为饲料食物或饲料中所包含的各种营养物质统称为营养素动物机体需要的营养素50余种可以概括为七大类蛋白质脂肪碳水化合物矿物质维生素纤维素和水小鼠营养需要的特点1820的蛋白质可满足需要喜食含糖量高的饲料糖的比重可适当大些泌乳期喜食含脂类高的饲料对维生素A的过量很敏感特别是妊娠小鼠过量会造成胚胎畸形对维生素A和D的需要量较高应注意补充影响动物营养需要的主要因素遗传和环境因素不同品种动物营养需要明显不同各品系间营养需要有明显差异在隔离或屏障环境中饲养动物其营养需要和同品系在普通环境中饲养动物的营养需要差别明显大鼠营养需要的特点1820的蛋白质即可生长期的大鼠易发生脂肪酸缺乏饲料中必需脂肪酸的需要量应占热能物质的13对镁的需要量较高应注意补充对营养缺乏敏感易产生营养缺乏症实验动物饲料质量的一般要求各种原料和添加剂的营养指标应采用实测值营养指标均以90干物质为基础配合饲料应混合均匀新鲜无杂质无异味无霉变无发酵无虫蛀及鼠咬各种实验动物配合饲料营养成分指标应符合国标要求需消毒灭菌饲料应根据不同消毒灭菌方法适当地提高相应营养成分的含量不得掺入抗生素驱虫剂防腐剂色素促生长剂以及激素等药物及添加剂饲料的消毒干热湿热辐照药物熏蒸近交系定义经连续20代以上的全同胞兄妹交配或亲子交配近交系数inbreedingcoefficient达到99品系内所有个体都可追溯到第20代或以后代数的一对共同祖先近交系数群体中某个体通过遗传携带两个同源等位基因的概率亚系定义由同一个近交系分离出来的有不同特性的分支这些分支间有遗传差异称为该品系的亚系亚系Substrain的形成在兄妹交配2040代时形成的分支主要原因是残留杂合Residualheterozygosity某分支与其它分支分开繁殖超过100代主要原因是突变发现一个分支与其它分支的差异原因为残留杂合突变或遗传污染Geneticcontamination近交系的主要特点1基因位点的纯合性近交系动物中任何一个基因位点上纯合子的概率高达99因而能繁殖出完全一致的纯合子品系内个体相互交配不会出现性状分离采用近交系动物进行实验时不会因为隐性基因的暴露而影响实验结果2遗传组成的同源性品系内所有动物个体都可追溯到一对共同祖先也就是说同一个品系内每只动物的个体在遗传上都是同源的基因型完全一致在同一品系内的动物个体间进行皮肤或其他组织移植植入物不会被当作异已而排斥是组织细胞和肿瘤移植试验中最为理想的材料3表型的一致性由于遗传上的同源性近交品系内个体在表型上极为相同近交系表型上的一致性使得使用较少量的动物即可达到统计学的精确程度4长期遗传的稳定性近交系动物虽然在遗传上并不是绝对稳定不变但是人为选择不会改变其基因型个体遗传变异仅发生在少量残留杂合基因作用基因突变和遗传污染三种情况下5遗传特征的可分辨性近交系一旦培育成功动物群体内几乎不再存在遗传多态性即每个位点只有一种基因类型而不会存在其它的等位基因6背景资料的完整性由于近交系动物在培育和保种的过程中都有详细记录加之这些动物分布广泛经常使用已有相当数量的文献记载着各个品系的生物学特征这些基本数据为设计新的实验和解释实验结果提供了便利条件重组近交系定义由两个近交系杂交后经连续20代以上兄妹交配育成的近交系命名由两个亲代近交系的缩写名称中间加大写英文字母X命名重组同类系定义由两个近交系杂交后子代与两个亲代中的一个进行数次回交通常回交2次而育成的近交系命名两个亲代近交系的缩写名称中间加小写英文字母c同源突变系定义两个近交系除了一个指明位点等位基因不同外其它遗传基因全部相同的品系命名由发生突变的近交系名称后加突变基因符号用英文斜体印刷体二者之间以连接号分开如DBAHaD同源导入系定义通过杂交互交Crossintercross或回交等方式将一个基因导入到近交系中由此形成的一个新的近交系与原来的近交系只在一个很小的染色体片段上的基因不同也称同类系命名由以下三部分组成a接受导入近交系缩写名称b提供导入基因的近交系缩写名称并与a之间用英文句号分开c导入基因符号英文斜体与b之间用连字符分开如B10129H12b表示该同类系背景为C57BL10导入基因为H12b基因提供者为129封闭群定义以非近亲交配方式进行繁殖生产的实验动物种群在不从外部引入新个体的条件下至少连续繁殖4代以上称为一个封闭群或叫远交群命名方法封闭群由24个大写英文字母命名种群名称前标明保持者的英文缩写名称第一个字母须大写后面字母小写一般不超过4个字母保持者名称与种群名称之间用冒号分开封闭群特点遗传组成具有很高的杂合性具有类似于人类群体遗传异质性的遗传组成具有较强的繁殖力生活力和抵抗力杂交群定义杂交群由不同品系或种群之间杂交产生的后代杂交一代动物F1代两个不同近交系杂交所生的第一代动物选择近交系动物繁殖方法的原则是保持近交系动物的同基因性及其基因纯合性近交系动物的繁殖可分为基础群foundationstock血缘扩大群pedigreeexpansionstock生产群选择封闭群动物繁殖方法的原则是尽量保持封闭群的动物的基因异质性及多态性遗传监测的目的是为了证实各品系应具有的遗传特性以及是否发生遗传突变和遗传污染等以确保被监测的样品符合该品系的要求毛色基因测试法生化标记基因检测法下颌骨测定法皮肤移植法按微生物控制程度分级1普通级动物ConventionalAnimalCV2清洁级动物除普通级动物应排除的病原体外不携带对动物危害大和对科学研究干扰大的病原体CleanAnimalCL3无特殊病原体动物简称SPF级动物除清洁动物应排除的病原外不携带主要潜在感染或条件致病和对科学实验干扰大的病原的动物在放射烧伤等研究中具有特殊的价值国际上公认SPF动物适用于所有科研实验是目前国际标准级别的实验动物各种疫苗生产所采用的动物应为SPF级动物SpecificPathogenFreeSPF4无菌动物GermfreeAnimalGF体内不存在任何可检测到的微生物及寄生虫包括悉生动物gnotobiotesanimalsGN也称为已知菌动物Animalwithknownbacterialflora是指动物携带或人工植入的确定生物体的一类实验动物这类动物一般用于特殊科研性实验1形态学改变1消化系统无菌动物和普通动物外观和活动之间看不出有特别的差异有时仅见有体重增加的差别据报道无菌动物的盲肠包括内容物的总重量有的可达到体重的252血液循环系统心脏相对变小白细胞数少且数量波动范围小与无病原体入侵有关3免疫系统胸腺网状上皮细胞体积较大胞浆内泡状结构和溶酶体少无菌兔胸腺以小淋巴细胞为主胸腺和淋巴结处于功能较不活跃状态脾脏缩小无二级滤泡网状内皮细胞功能下降2生理学改变1免疫功能由于网状内皮系统淋巴组织发育不良淋巴小结内缺乏生发中心产生丙种球蛋白的能力很弱血清中IgMIgG水平低免疫功能处于原始状态2生长率无菌条件下对不同种属影响不同无菌禽类生长率高于同种的普通禽类无菌大小鼠与普通鼠差不多无菌豚鼠和无菌兔生长率比普通者慢可能因肠内无菌不能帮助消化纤维素以提供机体所需要的营养所致3生殖无菌条件对动物生殖影响不大大鼠和小鼠因出生后无感染身体较好其繁殖力高于普通大小鼠无菌豚鼠及兔比普通者繁殖力低可能因盲肠膨大之故4代谢血中含氮量少肠管对水的吸收率低代谢周期比普通动物长5营养无菌动物体内不能合成维生素B和K故易产生这两种维生素的缺乏症6抗辐射能力抗辐射能力强X射线照射无菌小鼠的存活时间较长普通小鼠常因败血症而致死这是由于受损细胞的寿命在无菌小鼠与普通小鼠之间存在差别的缘故7寿命无菌动物寿命普遍长于普通动物检测频率普通动物每三个月至少检测动物一次清洁动物每三个月至少检测动物一次无特定病原体动物每三个月至少检测动物一次无菌动物每年至少检测动物一次每24周检测一次动物粪便标本基因打靶genetargeting是根据DNA同源重组的原理而设计的一项技术在这一技术中体内细胞基因组的某一段DNA序列被视为靶子经精巧构建的欲导入的外源基因DNA序列被视为弹头这样导入的外源基因进入受体细胞后就不再是随机整合而是弹头锚准靶子进行准确的定点整合通过DNA定点同源重组改变基因组中的某一特定基因从而在生物活体内研究此基因的功能如何使外源基因能定点整合于靶基因上呢根据DNA同源重组的原理导入的外源基因必须和靶基因有一定的同源序列因此外源基因导入前必须经过精巧的构建经构建的外源基因称为打靶载体targetingvector基因打靶的结局有如下可能1基因击入geneknockin在受体细胞基因组中定点引入一个完全新的基因2基因敲除geneknockout受体细胞内源靶基因被灭活3基因替代genereplacement靶基因被导入的外源基因替代可以是以正常基因替代突变的内源基因二基因打靶的方法进行基因打靶要经历以下步骤1构建打靶载体基因打靶的关键在于构建打靶载体在打靶载体中需要一个与靶基因同源的DNA片段这一片段称为同源重组指导序homologousrecombinationdirectingsequencesHRDS外源基因插入这一同源序列之中长度可从3kb至15kb2打靶载体导入受体细胞常用胚胎干细胞embryonicstemcell即ES细胞基因打靶所使用的受体细胞一般用胚胎干细胞ES细胞ES细胞是一种多潜能的干细胞能在体外传代而不改变其多潜能性小鼠胚胎干细胞是从着床前胚胎孕35天内细胞群分离的细胞1981年由英国剑桥大学的Evans和Kaufman首先分离培养成功1电穿孔法2逆转录病毒载体3脂质体包装法4磷酸钙沉淀法正负选择法的原理在构建打靶载体时打靶载体含有一段与靶基因同源的序列将新霉素抗性基因neor插入到该同源序列的第一个外显子中作为正选择标或者是靶基因最关键的外显子中neor可以抵抗G418在同源序列之外的末端接上单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶HSVtk基因序列作为负选择标志HSVtK可以利用GANC而导致细胞死亡3打靶ES细胞导入囊胚4囊胚植入假孕母鼠子宫发育同源重组如果导入的外源基因与靶基因发生同源重组外源基因以及neor基因将整合于靶细胞基因组的同源序列位点上而位于同源序列末端外的HSVtk基因则在重组后丢失此种情况下标志基因只有neor基因表达则靶细胞同时具有G418和GANC双重抗性可在选择性培养基中存活下来打靶ES细胞的鉴定与扩增筛选出G418RGANCR的细胞克隆后再用PCR方法进一步鉴定鉴定后的ES细胞克隆与囊胚体外共孵育或用显微注射的方法注入囊胚的胚泡中再将囊胚植入假孕母鼠的子宫中发育用基因打靶的方法产生的第一代子鼠为嵌合体chimera小鼠即小鼠由囊胚的细胞及经基因打靶的ES细胞共同发育而来因此并非小鼠的全部细胞中都整合有导入的外源基因为获得纯合子的转基因小鼠还需要用打靶后出生的雄性小鼠与提供囊胚的正常雌鼠交配即回交backcross回交后出生的子代鼠中有野生型的小鼠即完全不携带有外源基因也有杂合子的小鼠再用杂合子小鼠互交intercross从出生的子代鼠中可鉴定筛选出纯合子的基因打靶小鼠再经繁育可建立转基因小鼠品系其实验流程见下图三组织特异性基因打靶应用ES细胞和同源重组原理而发展起来的基因打靶技术使转基因动物的研究又向前迈进了一步但仍有其局限性主要问题是虽然通过基因打靶实现了外源基因在受体细胞基因组中的定点整合但这种整合是没有组织特异性的因此尚不能使外源基因仅在特定的组织中表达CreloxP系统的发现及应用实现了外源基因的组织特异性表达四外源基因的时间可控性表达实现了组织特异性基因打靶后导入的外源基因表达时间仍是无法控制的因而仍无法确定外源基因的表达在动物发育不同阶段中的作用另外由于外源基因表达的时间不能控制有时可造成转基因动物在胚胎期死亡为了解决这一问题Mentzger等人1995用编码Cre重组酶与人雌激素受体estrogenreceptorER融合蛋白的基因制备了CreER转基因小鼠给这种转基因小鼠注射人雌激素可诱导CreER的大量表达再用插入两个反向loxP序列之间的基因制备另一种基因打靶小鼠并使该基因DNA序列与其上游的启动子方向相反则该基因必须依赖Cre重组酶调转方向后方能表达转基因动物是指用实验的方法将外源基因导入早期胚胎细胞使之整合于细胞基因组中而建立的动物品系整合的外源基因称为转基因transgene最早建立成功的转基因动物是转基因小鼠transgenicmouse由于制备转基因小鼠比制备大的转基因动物要省时省力得多因此转基因小鼠技术作为生命科学研究的一个新的技术体系已经得到越来越广泛的应用特别是基因功能的研究外源基因导入方法1显微注射法2逆转录病毒载体法3电脉冲法转基因动物的应用1基因功能的研究2建立转基因动物生物反应器3异种器官移植转基因小鼠制备的基本程序1选择小鼠品系可以用远交系也可以用近交系一般采用两种近交系的杂交一代2准备不育雄鼠和假孕母鼠用输精管结扎的方法制备不育雄鼠不育雄鼠与雌鼠交配可获得假孕母鼠3收获受精卵超排卵显微注射需要的受精卵可以通过小鼠自然交配得到但数量常不能得到保证因而需对雌鼠施以激素以获得足够数量的受精卵即诱导超排卵46周龄雌鼠在明暗循环的动物房内饲养35天即可作超排卵一般以孕马血清PMS模拟卵泡刺激素FSH人绒毛膜促性腺激素hCG模拟黄体生成素LHPMS和hCG注射间隔4248小时排卵发生于注射hCG后1013小时4将导入外源基因的受精卵植入假孕母鼠的输卵管或子宫内发育5首建转基因鼠founder中转基因的检测6通过繁育建立转基因小鼠品系1互交得到转基因纯合子小鼠2回交至少10代建立纯系转基因小鼠实验动物设施Laboratoryanimalfacility是从事饲养育种保种生产动物实验等的建筑物设备以及运营管理在内的总和它是由实验动物繁育生产设施和动物实验设施两部分组成2实验动物繁育生产设施ProductionAnimalFacility指用于实验动物繁育生产的建筑物设备以及运营管理在内的总和3动物实验设施AnimalexperimentalFacility指以研究试验教学生物制品药品生产等为目的进行实验动物饲育试验的建筑物设备以及运营管理在内的总和按照实验动物环境与设施GB149252001规定实验动物环境设施分为三级控制程度从低到高依次为普通环境opencondition屏障环境barriercondition和隔离环境Isolationcondition1普通环境opencondition该环境设施符合动物居住的基本要求不能完全控制传染因子适用于饲养教学等用途的普通实验动物conventionalanimal2屏障环境barriercondition该环境设施适用于饲育清洁实验动物Cleananimal及无特定病原体实验动物SPFspecificpathogenfreeanimal该环境严格控制人员物品和环境空气的进出3隔离环境Isolationcondition该环境设施采用无菌隔离装置以保存无菌或无外来污染动物隔离装置内的空气饲料水垫料和设备均为无菌动物和物料的动态传递须经特殊的传递系统该系统既能保证与环境的绝对隔离又能满足转运动物时保持内环境一致该环境设施适用于饲育无特定病原体SPF悉生Gnotobioticanimal及无菌实验动物germfreeanimal影响实验动物的环境因素很多这里主要阐述实验动物饲养室内的环境因素对实验动物的影响例如温度湿度气流和速度噪声光照度空气中的微生物和颗粒物等