无花果多糖提取工艺及其功能讨论.docx

无花果多糖提取工艺及其功能讨论糖尿病及其并发症已成为继心脑血管疾病肿瘤之后严重危害人类健康的第三大常见病据世界卫生组织报告全世界目前约有亿患者预测年将上升到亿近年糖尿病及其病发症的发生率越来越高糖尿病慢性并发症的发生和发展与整体血糖水平的升高有密切的关系同时糖尿病长时间的高糖环境会导致糖脂代谢的紊乱从而引起脏器病变及并发症血液中糖化血红蛋白与血糖浓度成正比所以检测血中水平可以直观地反映出血糖水平更好地监测机体糖代谢的情况国外有学者研究证实了是诊断血糖水平的重要指标而且与空腹血糖甘油三酯低密度脂蛋白呈正相关在控制血糖水平的同时有效调节血脂代谢紊乱对治疗糖尿病及其并发症有重要意义植物多糖在自然界中广泛存在具有降血糖提高免疫力防止心肌缺血等复杂的生物活性与功能它能促进胰岛素分泌提高血浆胰岛素水平抑制糖异生途径和调控糖原的合成分解及促进血糖利用目前市场上治疗糖尿病的药物主要是化学合成药虽然短期疗效显著但常伴有不同程度的副作用如心血管疾病过敏反应等无花果为桑科无花果属植物的果实在甘肃省陇南市白龙江两岸栽培面积约有是甘肃省主要的无花果栽培基地无花果营养丰富无花果多糖系其主要有效成分但是由于其水溶性和分子量大给提取纯化带来了困难近年来有关无花果多糖提取工艺研究的报道较多但仅限于压榨水溶和溶剂萃取等传统提取方法的研究而且传统提取工艺复杂提取率低耗时也较长同其他植物多糖一样具有复杂的生物活性与功能有关无花果多糖在降血压防治神经痛抗凝血抗血栓抗氧化增强免疫力方面的研究逐渐增多而关于无花果多糖在降血糖血脂方面的研究较少鉴于此试验根据无花果多糖特点用酶法和响应面法联用进行提取工艺优化研究并采用诱导建立糖尿病大鼠模型来观察无花果多糖对糖尿病大鼠降血糖和降血脂的作用效果以期开发无毒无副作用的降糖替代药物对无花果多糖综合开发提供科学依据促进无花果产业经济的发展材料与方法材料与仪器试验材料与动物无花果采自甘肃省陇南市武都区白龙江沿岸品种为紫果挑选大小均匀成熟度相同无机械损伤颜色鲜艳无病虫害的果实大鼠雄性合格证号甘体质量试验动物和饲料均购自兰州大学基础医学院医学实验中心试验药品四氧嘧啶公司盐酸二甲双胍片上海医药集团有限公司信谊制药总厂生产格列苯脲片上海信谊药厂有限公司生产血糖试纸爱奥乐医疗器械深圳有限公司普鲁卡因肾上腺素注射液远大医药中国有限公司生产苯酚浓硫酸葡萄糖纯度公司复合酶纤维素酶万木聚糖酶万果胶酶三者比为和氏璧生物科技有限公司其他试剂均为分析纯试验仪器旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器厂数显恒温水浴锅上海千载科技有限公司高速台式离心机上海安亭科学仪器厂紫外可见分光光度计上海精密科学仪器有限公司型低速冷冻大容量离心机上海安亭科学仪器厂型冷冻干燥机北京四环科学仪器厂全自动生化分析仪贝克曼库尔特有限公司全自动血糖检测仪爱奥乐医疗器械深圳有限公司高压液相色谱仪配有示差折光检测器手动进样器柱温箱在线控制器和分析软件日本岛津公司和色谱柱日本公司等试验方法无花果多糖的提取流程将无花果果实在烘干后将其粉碎过目筛用无水乙醇回流脱脂时干燥然后加入一定量的水在一定温度下添加相应的复合酶进行一定时间的酶解通过复合酶的酶解彻底降解无花果中的纤维素和果胶使无花果多糖充分溶解便于提取提取液经过减压浓缩得浓缩液取上清液与试剂氯仿正丁醇体积比按体积比混合振荡离心弃去变性蛋白重复次合并水层用的乙醇沉淀体积比离心沉淀物溶于热水中搅拌状态下慢慢加入斐林试剂析出铜络合物静置倾出上清液用水洗涤次离心分离得络合物向络合物中加蒸馏水再滴加的使之全部溶解用的乙醇沉淀体积比离心所得絮状物分别用乙醇丙酮乙醚洗涤冷冻干燥得洁白无花果多糖粉无花果多糖含量的测定方法本试验采用苯酚硫酸法测定总的无花果多糖含量先把葡萄糖用苯酚硫酸试剂处理后进行紫外扫描在处有最大吸收再利用标准糖浓度和其用苯酚硫酸试剂处理后在处的吸光度制作标准曲线再测定待测样品溶液的吸光度然后根据回归方程计算相应的浓度从而求出多糖含量无花果多糖的提取率样品中多糖的含量稀释倍数样品干质量无花果多糖的单因素试验分别称取无花果粉末多份分别置于锥形瓶中用蒸馏水混匀调节至备用用时添加不同酶剂量搅拌均匀后用保鲜膜封口置于恒温摇床培养转速酶解以蒸馏水为空白对照重复次测定酶用量对提取无花果多糖的影响分别加入工业用复合酶测定温度对提取无花果多糖的影响取备用无花果粉末匀质液体加入工业用复合酶温度设置为的恒温培养箱内酶解测定对提取无花果多糖的影响在备用无花果粉末匀质液体中分别加入工业用复合酶以溶液和溶液调节成值分别为的系列梯度进行试验各单因素试验后测定无花果多糖来确定适合的单因素条件糖尿病动物模型建立将大鼠适应性喂养在禁食不禁水后称质量测量随机取只大鼠作为正常对照组将其余只大鼠腹腔一次性注射新鲜配制的溶液后眼眶静脉丛采血用血糖仪测定将者视为造模成功糖尿病模型组等量生理盐水每天灌胃一次二甲双胍药物对照组按剂量每天灌胃一次纹党多糖低中高剂量组每天灌胃一次试验期间大鼠自由饮食和饮水连续观察每隔测定和称量体质量测定前禁食不禁水对正常大鼠血糖水平的影响取大鼠只随机分为组空白组等容量生理盐水格列本脲对照组纹党多糖低中高剂量组各组灌胃给药次连续末次给药前禁食给药后眼眶静脉丛采血用血糖仪测定的血糖值对肾上腺素引起高血糖大鼠血糖水平的影响取大鼠只随机分成组分组及给药方法同设肾上腺素为对照组末次给药前禁食给药后各组腹腔注射肾上腺素后眼眶采血测定大鼠急性毒性试验测定小鼠急性毒性试验半数致死量以纹党多糖一次性灌胃给药约等于相当于观察看有无异常反应小鼠是否活动自如检测指标末次给药后各组大鼠禁食不禁水采用血糖仪和血糖试纸剪尾取血测各组大鼠测定后迅速处死动物并采血离心收集血清采用全自动生化分析仪测水平统计分析试验数据均以表示数据分析采用统计分析软件进行检验统计处理结果与分析无花果多糖的纯度检测无花果多糖溶液的紫外光谱在和波长处未见蛋白质和核酸的特征吸收无花果种子多糖的色谱图只出现一个峰保留时间为所检测到的峰没有裂峰的出现说明分离和纯化的无花果种子多糖是由一种多糖组成的面积归一化计算纯度为多糖测定标准曲线的确立以标准液浓度为横坐标吸光度值为纵坐标得标准曲线计算回归方程相关系数线性良好影响无花果多糖的单因素试验不同的酶解温度对无花果多糖溶出率的影响无花果多糖的提取率之间差异较为明显在时无花果多糖的提取率最高因此温度选择以上考虑到酶解温度以及能量节约宜选择提取温度为中可以得出无花果多糖含量随着溶液值的增加呈先增加后减少的趋势当溶液的值达到时含量达到最大值当溶液的值超过时多糖的溶出率反而减少说明这时溶液的值超过酶的最适活性开始降低所以最佳值为不同酶用量对无花果多糖溶出率的影响见图无花果多糖溶出率随着复合酶的增加而增加无花果多糖在酶用量为处增加明显无花果多糖溶出率有最大值此后维持稳定说明此时酶量足够已经与底物充分作用因此复合酶的最佳酶用量为无花果多糖提取工艺条件响应面分析试验以单因素试验结果为依据利用软件设计了三因素三水平的响应面法试验以酶解温度酶用量和为主要考查因素分别用和来表示并以表示自变量的高低水平以无花果多糖含量为响应值表现出个试验点因素水平见表试验设计二次回归拟合及方差分析和结果见表从回归分析中可以得出两者的一次项二次项均有显著影响各试验因子对响应值的影响呈显著的线性关系各试验因子对无花果多糖的响应值的影响分别为方差分析结果由表可知模型说明酶解温度酶用量和及其二次项对无花果多糖的影响极显著而交互项无显著影响无花果多糖模型决定系数为经拟合检验无花果多糖差异极显著由此说明方程能很好地反映无花果多糖含量与酶解温度酶用量和之间的关系而且对无花果多糖提取率影响的大小顺序为酶解温度酶用量因此可以应用于无花果多糖含量提取的理论预测依据回归方程个因素的响应面图如图相应的响应面均为凹型曲面说明无花果多糖的含量响应值存在着极高值且响应曲面的等高线中心均位于说明提取的最优条件存在于所设计的因素水平范围之内通过分析两者的响应面分析结果可以确定无花果多糖的提取最优工艺参数为酶解温度为酶用量为和为在此条件下无花果多糖的最高含量为无花果多糖提取工艺优化条件的重复试验验证结果由表可知无花果多糖的平均提取率为预测值比较两者无显著差异所以经过验证此优化条件是最佳组合工艺无花果多糖对正常大鼠血糖水平的影响格列本脲是降低血糖的特效药物之一由于其能刺激胰腺分泌胰岛素而降低血糖还通过增加门静脉胰岛素水平或对肝脏直接作用抑制肝糖原分解和糖原异生作用也可增加胰外组织对胰岛素的敏感性和糖的利用而缓解人体高糖环境所以医疗使用范围较广对正常大鼠血糖水平的影响研究结果表明无花果多糖低中高剂量组均能降低正常大鼠血糖与空白组比较差异极显著性其降糖效果与格列本脲组相当格列本脲能刺激胰腺胰岛细胞分泌胰岛素还通过增加门静脉胰岛素水平或对肝脏直接作用抑制肝糖原分解和糖原异生作用也可能增加胰外组织对胰岛素的敏感性和糖的利用无花果多糖对肾上腺素引起高血糖大鼠血糖水平影响肾上腺素是肾上腺髓质分泌物能使肝糖元分解阻碍葡萄糖进入肌肉及脂肪组织细胞促使血糖升高对肾上腺素引起高血糖大鼠血糖水平的影响研究表明无花果多糖对肾上腺素引起的大鼠血糖升高具有明显的抑制作用结果见表而这种抑制小鼠糖代谢的作用可能是通过促进胰岛素的释放提高胰岛素敏感性从而增加外周组织对葡萄糖的利用和增加肝糖元合成调节糖代谢和抑制糖异生过程来完成降低血糖的作用无花果多糖对糖尿病大鼠血糖的影响是一种常用的诱导大鼠产生型糖尿病的物质其致病原因在于它能破坏小鼠的胰岛细胞导致氧化应激而升高血糖通过对大鼠进行腹腔注射对大鼠胰岛细胞进行特殊的破坏从而减少胰岛素的来源使大鼠血糖升高小鼠进食量饮水量尿量显著增加体形明显消瘦行动迟缓说明诱导糖尿病模型成功无花果多糖对造模成功后糖尿病大鼠血糖的作用见表与正常组大鼠相比各组大鼠血糖均明显升高有极显著差异连续灌胃给药后二甲双胍组大鼠血糖在不同时期均明显降低与模型组相比差异极显著无花果多糖中剂量组大鼠的血糖值与模型组相比差异显著而高剂量组与模型组比较血糖明显降低差异极显著结果表明无花果多糖对糖尿病模型大鼠具有明显的降血糖作用而且这种降血糖作用以高剂量组效果最好与二甲双胍组的降糖效果相仿无显著差异无花果多糖对糖尿病大鼠糖化血红蛋白的影响糖化血红蛋白是人体血液中与葡萄糖通过非酶促的缓慢结合所形成的一种血红蛋白组分与血糖浓度成正比所以检测血中水平可以直观地反映出血糖水平能更好地反映机体糖代谢的情况无花果多糖对糖尿病大鼠糖化血红蛋白的作用见表无花果多糖高中剂量组大鼠糖化血红蛋白含量显著下降与模型组比较具有显著性差异和低剂量组大鼠糖化血红蛋白含量与模型组比较无显著性差异说明无花果多糖能够降低糖尿病大鼠水平其高剂量效果与二甲双胍组相当这也说明多糖能刺激致糖尿病大鼠的胰岛细胞的再生并释放胰岛素使胰岛素分泌增多降低糖尿病大鼠水平有效调节和改善糖代谢水平降低大鼠血清葡萄糖水平无花果多糖对糖尿病模型大鼠血脂代谢的影响无花果多糖对糖尿病大鼠血脂代谢的结果见表与正常组相比糖尿病模型大鼠和均显著升高而显著降低给药周后模型组与二甲双胍组比较和均有明显升高无花果多糖高剂量组与糖尿病模型组比较大鼠的和有极显著性差异其对糖尿病模型大鼠血脂的调节作用与二甲双胍组相当两组的及含量均无显著性差异结果表明无花果多糖可以调节糖尿病大鼠血脂无花果多糖对大鼠急性毒理试验大鼠急性毒性试验半数致死量未能测出一次性灌胃给药约等于无花果多糖观察大鼠给药后外观毛色光亮无兴奋不安窜动跳跃竖毛流泪流涎凸眼扭体反应现象给药后摄食进水大小便等均无明显异常观察期间未出现死亡和异常反应大鼠活动自如并对大鼠进行颈椎脱臼处死然后进行心肝肺脾肾子宫睾丸卵巢肠等重要脏器病理检查均未出现出血充血水肿渗出溃疡穿孔胸腔腹腔心包膜无积液等明显病理变化结果说明无花果多糖是一种无毒物质讨论与结论通过酶法和响应面法联用对无花果主要活性成分多糖进行提取工艺优化研究在提取研究过程中发现酶解时间是一个动态变化的过程很难确定最佳时间但是在酶解后多糖产率达到稳定所以将酶解时间确定为通过响应面分析结果确定了无花果多糖的提取最优工艺参数为酶解温度酶用量和该条件下无花果多糖提取预测值为验证值为目前提取无花果多糖的方法有很多种传统提取方法主要是水提法操作繁琐时间长而且提取率相对较低酶解法条件温和操作简单节约原材料有较高的提取率无花果多糖提取过程中会因为一些杂质类成分如淀粉蛋白质果胶等而影响提取液的质量而适当的酶通过温和的酶解反应可将液体中杂质除去从而提高体系澄清度单独用复合酶法提取无花果多糖提取率相对较高但其耗时较长而且酶解法中温度和值都是影响酶解产物的重要因素它们不但影响酶的稳定性而且还影响酶的活性中心必需基团的解离状态和底物的解离状态在最适值和温度范围内底物才能与酶充分的结合产生大量的产物所以用响应面法和酶解法联用优化无花果多糖的提取工艺时将温度和值设计到最佳条件改变了以往提取时无花果资源的严重浪费对无花果的资源开发和利用具有重要的现实意义本试验研究无花果多糖对四氧嘧啶诱导糖尿病大鼠血糖和血脂的影响以腹腔注射建立大鼠糖尿病模型连续灌胃给药研究对糖尿病大鼠空腹血糖糖化血红蛋白总胆固醇甘油三酯高密度脂蛋白低密度脂蛋白訽等指标的影响研究表明大鼠进食量饮水量尿量显著增加体形明显消瘦行动迟缓符合糖尿病三多一少的症状且胰岛细胞破损明显导致糖尿病模型组大鼠的明显高于正常对照组经过的灌胃治疗无花果多糖治疗组不同程度地降低了大鼠的高剂量治疗组的降糖效果显著无花果多糖处理降低了大鼠含量作用效果与二甲双胍组接近与正常组相比糖尿病模型组大鼠和浓度显著升高的含量有所下降与糖尿病模型组相比无花果多糖各剂量组均能使糖尿病大鼠血清中含量降低同时提高含量说明能够改善糖尿病大鼠血脂代谢紊乱的情况无花果多糖高剂量治疗后主动脉内膜相比模型组较完整平坦内皮黏附及浸润于内膜的单核细胞明显较少内膜增厚明显轻于模型组说明无花果多糖可以调节降低糖尿病大鼠血脂对糖尿病大鼠的血管并发症有一定的改善作用对治疗高脂血症预防动脉粥样硬化冠心病等方面具有广阔的开发前景有望成为一种新型调节血脂的保健食品本研究中一次性灌服无花果多糖最大剂量为远远大于毒理学评价标准大鼠急性毒性试验半数致死量未能测出大鼠给药观察后未出现死亡和异常反应大鼠活动自如说明无花果多糖对大鼠安全无毒虽然无花果多糖的降血糖作用不如口服降血糖药二甲双胍那么强但其作用比较温和不会出现二甲双胍那样强烈的低血糖反应也是其突出的优点用来开发无毒无副作用的降糖替代药物具有重要意义