异鼠李素对B16细胞黑色素生物合.docx

异鼠李素对细胞黑色素生物合成途径中关键基因表达量的影响生物制药摘要异鼠李素是广泛存在于自然界中的一种黄酮类化合物具有抗肿瘤生物活性细胞毒性较低可应用于肿瘤防治为了探讨异鼠李素对细胞黑色素生物合成途径中关键基因表达量的影响本文以异鼠李素和小鼠黑素瘤细胞为试验对象就异鼠李素对细胞黑色素生物合成途径中关键基因表达量的影响展开研究通过荧光定量检测基因的表达量发现这些基因的表达量与异鼠李素的浓度并不成线性关系但是异鼠李素处理组与实验组相比和的表达量有所下降酪氨酸酶活和黑色素含量有所下降研究认为异鼠李素不是通过调节基因的表达量来调节黑色素的含量且其作用机制可能是在复制和转录水平上起作用为后期异鼠李素对黑色素瘤细胞增殖凋亡调控机制的研究提供了理论基础关键词异鼠李素荧光定量反转录前言黑色素瘤通常是指恶性黑色素瘤它主要来源于皮肤粘膜眼和中枢神经系统由于这些区域的黑色素细胞聚集堆积从而发展为高度的恶性肿瘤其最主要的发生部位是皮肤然而正常皮肤的黑色素细胞转化成黑色素瘤细胞的作用机制还不明确目前的研究认为皮肤黑色素瘤的发病机制是多因素多步骤共同作用的结果其发生发展的过程涉及一系列抑癌基因的改变根据临床表现和病理组织学常见病理类型有浅表扩散型黑素瘤结节型黑素瘤恶性雀斑痣样黑色素瘤肢端雀斑痣样黑素瘤近年来恶性黑色素瘤在所有癌症中发病的增长率最高而且容易发生转移病情发展的速度较快预后较差最后导致死亡率相对较高至今没有治疗黑色素瘤较好的药物近年来大量的实验研究表明中药具有诱导肿瘤细胞调亡的作用通过中药的某个有效成分来激活体内的抗肿瘤基因或者引起促调亡基因的表达寻找相关蛋白基因的通路使肿瘤细胞的周期发生阻滞从而阻断细胞从一个时期向另一个时期进行转换最终达到抑制其增殖诱导其调亡的目的异鼠李素是广泛存在于自然界中的一种黄酮苷元在植物沙棘银杏蒲黄鹿蹄草中含量丰富亦存在于其他多种植物的茎花和叶里大量研究表明异鼠李素具有保护心血管抗氧化抗肿瘤抗炎抗过敏及调节免疫功能等多种药理作用本研究通过检测了异鼠李素各基因的表达量以及其相关影响材料与方法实验材料和仪器实验材料小鼠黑色素瘤细胞株购自中国科学院上海细胞生物研究所细胞库主要试剂胰蛋白酶消化液高糖培养基胎牛血清澳洲胎牛血清依科赛青链霉素双抗染液购自碧云天购自碧云天试剂盒购自全式金实验仪器表实验仪器仪器名称型号生产厂家二氧化碳细胞培养箱公司数显恒温水浴锅国华电器有限公司高速低温离心机公司德国倒置显微镜日本计科学仪器有限公司琼脂糖水平电泳槽和电泳仪北京百晶生物技术有限公司凝胶成像仪型公司德国聚丙烯酰胺凝胶电泳装置公司美国电子分析天平科学仪器有限公司超低温冰箱公司日本旋涡混合器型上海医科大学仪器厂细胞培养板公司美国细胞培养瓶公司美国扩增仪公司德国超净工作台苏州净化设备厂高压灭菌锅公司日本相关试剂配制完全培养基含血清双抗青霉素链霉素用高糖培养基定容胰酶终止液含血清用高糖培养基定容多巴底物用溶解避光分装冻存细胞蛋白提取裂解液临用前加母液按加入水母液定容至通风橱过夜二次高压灭菌硼酸灭菌后用水定容至电泳琼脂糖凝胶琼脂糖定容加入的去离子水充分搅拌溶解后加入的醋酸充分混匀最后加去离子水定容至室温保存电泳琼脂糖凝胶琼脂糖用定容实验方法细胞培养方法细胞冻存细胞在培养瓶中培养至对数生长期弃培养基后用清洗加入胰酶消化约待细胞变圆后继续加入终止液含血清的培养基终止消化吹打使细胞悬浮将悬浮液完全转移至离心管中离心离心条件室温收集细胞离心后弃上清液加入冻存液血清吹打悬浮细胞后转移至冻存管程序降温湿盒降温于冻存或者冻存管置于后转移至降温最后置于冻存不宜放置太久易产生冰晶损伤细胞冻存液冻结即可转移细胞复苏取冻存细胞于水浴中快速解冻适当速度持续晃动冻存管解冻后悬浮细胞并转移至安剖瓶中加入完全培养基含血清抗生素于培养箱中进行培养培养箱条件每天观察清洗死细胞更换新鲜培养基直至生长情况良好后传代细胞传代培养瓶中的细胞弃培养基后用清洗加入胰酶消化约至细胞变圆后继续加入终止液含血清的培养基终止消化完全转移至离心管中离心条件室温离心收集细胞离心后弃清液加入培养基吹打悬浮细胞后分瓶培养每瓶加入完全培养基于培养箱中进行培养细胞计数将待计数的细胞悬液吹打均匀用移液枪移取细胞悬液滴到细胞计数板的计数区盖上盖玻片不要有气泡将制好的细胞装片放到荧光倒置显微镜下观察计算出计数板四大格细胞总数压线细胞只计算左侧和上方的然后按下列公式计算细胞数大格细胞总数稀释倍数细胞药物处理弃培养基后用清洗加入胰酶消化约至细胞基本变圆继续加入终止液含血清的培养基终止消化完全转移至离心管中吹打混匀细胞后取细胞悬液在血细胞计数板上进行计数计算公式细胞数大格细胞数之和离心离心条件室温收集细胞离心后弃上清液根据接种量和计数结果加入适当体积的培养基悬浮混匀细胞接种到培养板中补足培养基于培养箱中进行培养接种至细胞贴壁后更换含不同浓度药物的培养基培养表细胞接种量实验操作方法和的基因转录受到的调控而是黑色素细胞和黑色素瘤中的一种组织特定转录因子对于黑色素细胞的增殖和黑色素的生成具有关键作用本实验主要通过半定量和比较经不同浓度异鼠李素处理后黑色素瘤细胞中等基因表达水平的差异异鼠李素配制称取异鼠李素用溶解再用完全培养基定容至配成的异鼠李素溶液依次用培养基稀释配制成个浓度用针筒细菌滤器过滤细胞培养将上述细胞株用含有胎牛血清的完全培养基在体积分数为完全饱和湿度条件下常规培养更换培养基细胞生长达饱和状态时用胰蛋白酶消化传代天传代次实验选用对数生长期细胞细胞的提取待培养瓶中的细胞生长至对数期弃去培养基后用清洗加入胰酶消化约至细胞变圆后继续加入终止液含血清的培养基终止消化完全转移至离心管中离心条件室温离心收集细胞离心后弃上清液用完全培养基调节细胞浓度约为个每孔细胞悬液接种于孔板中继续培养小时使细胞贴壁弃去旧的培养基药物处理后取出孔培养板清洗后加入冰浴裂解转移液体到离心管中加入氯仿剧烈震荡混匀离心离心后转移上层水相加入等量异丙醇涡旋震荡充分混匀后于下静置沉淀离心后小心移除上清沉淀中加入无水乙醇弹起沉淀漂洗离心重复洗涤次后除尽乙醇室温晾干沉淀约加入溶解轻弹离心管混匀微量分光光度计测定浓度和纯度并进行电泳电泳条件琼脂糖凝胶电泳缓冲液电压电流时间鉴定的制备反转录使用反转录试剂盒反转录体系如下表反转录体系计算浓度稀释后加轻轻混匀反转录反应体系后于孵育迅速转入加热失活置于保存实时荧光定量表引物序列引物名称上游下游引物扩增片段大小上游下游上游下游上游下游上游下游上游下游上游下游上游下游检测反应体系表反应体系反应条件采用试剂盒和伯乐公司的仪进行扩增扩增程序为预变性变性退火延伸个循环利用分析数据结果与分析利用检测各基因表达量用对数据进行分析结果如图所示基因表达量变化与异鼠李素浓度之间不成线性关系异鼠李素浓度升高时基因表达量上升基因表达量也表现出升高趋势而和基因表达量反而表现为下降趋势图检测异鼠李素作用下各基因表达量的变化注是指小结通过荧光定量检测基因的表达量发现这些基因的表达量与异鼠李素的浓度并不成线性关系但是异鼠李素处理组与实验组相比和的表达量有所下降酪氨酸酶活和黑色素含量有所下降说明异鼠李素不是通过调节基因的表达量来调节黑色素的含量参考文献罗玲吴凯南吴晓健槲皮素对乳腺癌细增殖及凋亡的影响中草药向廷秀陶小红姜政等槲皮素对胃癌细胞生长及和表达的影响西安交通大学学报医学版李垚王鹏祖张慧颖异鼠李素对人胃癌细胞生长的抑制作用中国初级卫生保健杨春蕾王正荣张敏异鼠李素对人肺癌细胞抑制作用的观察航天医学与医学工程朱玲王正荣周黎明异鼠李素及黄酮对人肺癌细胞人乳腺癌细胞的影响四川生理科学杂志朱玲王正荣杨春蕾异鼠李素对肺癌的影响及其抗肿瘤机制的初步探讨四川生理科学杂志朱玲王正荣周黎明等异鼠李素对肺癌的作用及其抗肿瘤机制的初步探讨航天医学与医学工程