芸香苷对黑色素瘤细胞增殖的影响研究.docx

中国医科大学 毕业设计（论文） 芸香苷对黑色素瘤细胞增殖的影响研究 学院名称 学院名称 专业名称 生物制药 学生学号 学生学号 学生姓名 学生姓名 指导教师 教授姓名 助理指导老师 老师姓名 202X年X月 芸香苷对黑色素瘤细胞增殖的影响研究 生物制药 摘要：黑色素细胞瘤是源于表皮正常黑色素细胞或原有痣细胞的一种恶性肿瘤，当前对黑色素瘤的治疗主要是通过调节酪氨酸酶活性的调节和表达水平，为了探讨黄酮类物质芸香苷对黑色素瘤细胞增殖的影响，本文以芸香苷和小鼠B16黑素瘤细胞为试验对象，体外培养细胞并通过DAPI染色，对其细胞周期阻滞情况进行测定。结果表明，经芸香苷处理的黑色素瘤细胞G2、M期细胞数量降低，G1期细胞比例上升，说明芸香苷能明显抑制小鼠黑色素瘤细胞增殖作用。为后期研究芸香苷对黑色素瘤细胞的调控作用机制提供了研究方向和理论基础。 关键词：芸香苷；黑色素瘤细胞；增殖 1 前言 黑色素细胞瘤是源于表皮正常黑色素细胞或原有痣细胞的一种恶性肿瘤，恶性程度高，且尚无有效的治疗方法，治愈率低，是皮肤癌致死的主要肿瘤（75%）。以往的研究表明，恶性黑色素瘤与正常黑色素细胞相比，其酪氨酸酶表达会上调并产生明显的活性提高，说明黑色素细胞瘤的发病与酪氨酸酶的表达及活力具有直接关系。因此，对酪氨酸酶活性的调节和表达水平的调控是当前治疗黑色素瘤的重要方式。 芸香苷（图1）是一种广泛存在于植物体内的黄酮醇配糖体，1g能溶于8L水；200ml沸水；7ml沸甲醇，还能溶于二甲基亚砜和吡啶、甲酰和碱液，微溶于乙醇、丙酮和乙酸乙酯，几乎不溶于水、氯仿、醚、苯、二硫化碳和石油醚。稀溶液遇三氯化铁呈绿色，无水物易吸潮。具有使人体维持毛细管正常抵抗力和防止动脉硬化等功能，在医药上一直作为治疗心血管系统等疾病的辅助药物和营养增补剂。具有平喘、止咳、抗菌作用，由于它对人体没有毒性，因此在食品工业上还可作为抗氧化剂和天然食用黄色素使用。因此，为了探讨黄酮类物质对黑色素瘤细胞的活性，本文以芸香苷和小鼠B16黑素瘤细胞为试验对象，就芸香苷对体外培养的B16细胞增殖影响展开研究。通过对不同浓度芸香苷培养后的B16细胞进行周期测定，发现相比于正常体外培养细胞，经芸香苷处理后胞数量降低，G1期细胞比例上升，发现芸香苷能抑制B16黑色素瘤细胞的增殖，引起细胞凋亡。为后期芸香苷对黑色素瘤细胞增殖、凋亡调控机制的研究提供了理论基础。
图  SEQ 图 \* ARABIC 1 芸香苷化学结构式 2 材料与方法 2.1 仪器与材料 2.1.1 实验仪器 二氧化碳细胞培养箱、HH-6中数显恒温水浴锅、高速低温离心机、正置荧光显微镜、超净工作台、高内涵分析仪、血细胞计数板等。 2.1.2 试剂 DPBS、胰酶、10%血清、DMEM、新鲜培养基（10%血清、1%抗生素）、PBS、多聚甲醛、NaCl、Tris碱、盐酸、CaCl2、MgCl2、BSA、DAPI、DMSO、芸香苷药物等。 2.1.3 试剂配制 （1）固定液：将4g多聚甲醛加入80mL PBS中，搅拌过夜或者搅拌过程中微热直至固体全部溶解，定容至100mL就成为4%的多聚甲醛固定液。 （2）DAPI染色液：在500mL水中加入8.5gNaCl和1.2gTris碱，用盐酸调pH值至7.4，再加入4mL 500mM的CaCl2和44mL 500mM的MgCl2以及0.05g的BSA；最后加入10mg的DAPI和100mL的DMSO，定容至1L，4度保存。 2.2 基本操作 2.2.1 细胞冻存 细胞在培养瓶中培养至对数生长期，弃培养基后用2mL DPBS清洗，加入2mL胰酶消化90s，继续加入4mL终止液（10%血清）终止消化，完全转移至15mL离心管中（离心条件：室温25℃，1000rpm，10min），离心收集细胞。离心后弃清液，加入1.8mL冻存液（DMEM：血清：DMSO=5：4：1）吹打悬浮细胞后转移至冻存管，程序降温湿盒-80℃降温24h，于-80℃冻存。（或冻存管置于4℃10min后，转移至-20℃降温30min-2h，最后置于-80℃冻存；-20℃不宜放置太久，易产生冰晶损伤细胞，30min-2h冻存液冻结即可转移）。 2.2.2 细胞复苏 取冻存细胞于37℃水浴中快速解冻（适当速度持续晃动冻存管），解冻后悬浮细胞并转移至安剖瓶中，加入5mL新鲜培养基（10%血清、1%抗生素）于培养箱中进行培养（培养箱条件：37℃、5% CO2）。每天观察，清洗死细胞，更换新鲜培养基，直至生长情况良好后传代。 2.2.3 细胞传代 培养瓶中的细胞弃培养基后用2mL PBS清洗，加入2mL胰酶消化90s，继续加入4mL终止液（10%血清）终止消化，完全转移至15mL离心管中（离心条件：室温25℃，1000rpm，10min），离心收集细胞。离心后弃清液，加入2mL培养基吹打悬浮细胞后分瓶培养，每瓶加入5mL新鲜培养基于培养箱中进行培养。 2.2.4 细胞药物处理 弃培养基后用2mL PBS清洗，加入2mL胰酶消化90s，继续加入4mL终止液（10%血清）终止消化，完全转移至15mL离心管中，吹打混匀细胞后取200μL细胞悬液在血细胞计数板上进行计数（计算公式：细胞数/4*6*10^4）。离心（离心条件：室温25℃，1000rpm，10min）收集细胞。离心后弃清液，根据接种量和计数结果加入适当体积的培养基悬浮混匀细胞接种到培养板中，补足培养基，于培养箱中进行培养（表1）。 表 SEQ 表 \* ARABIC 1 数据 细胞培养板 接种量 培养基（mL） 6孔 50万/