双水相萃取菠萝蛋白酶的工艺研究.doc

论文写作指导论文资源网最专业的毕业设计分享平台目录摘要引言双水相萃取分离技术双水相形成机理影响物质分配平衡的因素菠萝蛋白酶在双水相体系中的萃取原理论文研究的主要内容材料与方法实验材料材料设备实验方法双水相体系的确定相图的绘制蛋白标准曲线的绘制菠萝粗酶的提取双水相体系的建立双水相萃取操作方法菠萝蛋白酶酶活测定法结果与分析每菠萝下脚料中含有的菠萝蛋白酶含量及菠萝蛋白酶的活性不同分子量的体系相图的制作的分子量对菠萝蛋白酶的分配系数相比及酶活回收率的影响浓度对菠萝蛋白酶的分配系数相比及酶活回收率的影响浓度对菠萝蛋白酶的分配系数相比及酶活回收率的影响外加盐浓度的不同对菠萝蛋白酶的分配系数相比及酶活回收率的影响讨论参考文献致谢双水相萃取菠萝蛋白酶的工艺研究双水相萃取菠萝蛋白酶的工艺研究生物工程专业摘要菠萝蛋白酶是典型的巯基蛋白酶能分解蛋白质肽酯酰胺应用范围极广而双水相萃取技术与传统的萃取技术相比具有操作条件温和处理量大易于连续操作等优点从而使其广泛应用于生物分离工程中本文研究了不同分子量浓度质量分数以及外加盐等因素对菠萝蛋白酶酶活回收率分配系数及相比的影响实验结果表明平均分子量浓度浓度为室温的情况下其分配系数达到酶活性回收率可达相比为当加入一定浓度不利于菠萝蛋白酶进入相对菠萝蛋白酶活性有一定影响而加入和明显使菠萝蛋白酶活性降低关键词双水相聚乙二醇菠萝酶萃取双水相萃取菠萝蛋白酶的工艺研究双水相萃取菠萝蛋白酶的工艺研究引言菠萝蛋白酶简称菠萝酶英文名编号为浅黄色无定形粉末分子量微有异臭微溶于水不溶于乙醇丙酮氯仿乙醚等电点菠萝蛋白酶广泛存在于菠萝的果实果皮芽叶茎中是典型的巯基蛋白酶能分解蛋白质肽酰胺菠萝酶是菠萝下脚料综合利用的重要产品之一一种新的生物化学制品它主要是存在于菠萝植株中的蛋白质水解酶一般从菠萝汁或菠萝废皮中提取菠萝蛋白酶能分解蛋白质肽酯和酞胺它的水解蛋白的活性较木瓜酶倍以上经过大量的研究表明菠萝酶有着广泛的用途它可以抑制肿瘤细胞的成长并且作为蛋白水解酶对心血管疾病的防治是有益的而且它与木瓜蛋白酶不同还可以水解纤维蛋白酪蛋白及血红蛋白使得纤维蛋白与血凝块溶解改善体液循环增加组织通透性导致炎症水肿和血肿的消退在制革食品饮料等生产中应用很多在医学上用之医治炎症等多种疾病特别对橡胶脱蛋白效果也很显著其水解蛋白质的活性大适应性广在医学方面将菠萝蛋白酶与各种抗生素如四环素阿莫西林等联用能提高其疗效菠萝蛋白酶是一种具有消炎抗水肿作用的疏基酶它能促进抗生素在感染部位的传输从而减少抗生素的用药量可以用于各种原因所致的炎症水肿血肿支气管炎支气管哮喘急性肺炎乳腺炎等治疗与抗菌药物合用治疗关节炎蜂窝组织炎小腿溃疡呼吸系统的各种炎症和尿路感染有一种复方菠萝酶片含有菠萝酶和猪胆汁浸膏粉的肠溶衣片除去肠衣后显灰棕褐色是一种疗效不错的祛痰镇咳药菠萝蛋白酶还具有嫩肤美白去斑的优异功效菠萝蛋白酶可采用高岭土吸附法单宁沉淀法超滤法等方法进行提取高岭土吸附法生产工艺和操作都比较复杂原材料消耗多所需设备也多酶活总回收率低但产品质量较好纯度较高产品酶活可达以上单宁沉淀法工艺和操作比高岭土法简单原材料消耗少所需设备少但酶活回收率较低产品酶活力在之间超滤法生产工艺和操作比较复杂且设备一次性投资大超滤浓缩后的浓缩液若再用高岭土吸附法或者单宁沉淀法提取可大大节约其他辅助原料的用量总生产成本减少且产品质量好纯度高酶活力高酶活总回收率高经济效益明显比传统工艺好综合这几种方法来看粗品种含有的残留的化学物质不能满足食品级酶的质量要求相对于传统溶剂萃取来说双水相萃取优势在于双水相体系可以双水相萃取菠萝蛋白酶的工艺研究为生物活性物质提供一个温和的环境可在萃取过程中保持生物物质的活性及构象且收率高成本低可连续化操作应用前景非常广阔双水相萃取分离技术双水相萃取技术简称利用双水相体系通过选择合适的成相与分配条件使酶蛋白质及菌体等生物大分子在两相中有不同比例的分配从而实现其纯化它是近年出现的极有应用前途的新型生物化工分离技术双水相萃取分离过程条件温和可调节因素多易于放大和操作设备简单并可借助传统溶剂萃取的相关理论和经验不存在有机溶剂残留问题而且可直接与后续提纯工序相连接无需特殊处理特别适用于生物物质的分离和提纯因此近年来受到研究者的重视尤其是它对生物活性物质的纯化分离能力更为研究者所关注双水相萃取技术是目前为止对生物活性物质纯化分离最有希望应用于大规模工业化生产的技术双水相形成机理双水相体系是指某些有机物之间或有机物与无机盐之间在水中以适当的浓度溶解后形成互不相溶的两相或多相水相体系从溶液理论上说来当两种或多种有机物和水溶液相互混合时是分层还是混合成一相取决于混合时熵变问题和分子间的相互作用力两个因素双水相体系的形成机理是盐析作用的结果对于具体形成机理和溶液理论有待于进一步探索影响物质分配平衡的因素双水相萃取法属于液液萃取物质在双水相体系中的分配系数不是一个确定的量其影响因素非常复杂很难建立完整的热力学理论体系来研究其分配影响分配平衡的主要参数有成相聚合物的分子量和浓度体系的体系中的盐的种类和浓度体系中菌体或细胞种类和浓度体系温度等等选择合适的条件可以达到较高的分配系数较好的分离目的物聚合物的影响聚合物对分配率的影响分为聚合物的平均分子量对分配率的影响和聚合物的浓度对分配率的影响分子量的减少会使蛋白质在两相中的分配系数明显增大由于成相聚合物的疏水性对酶等亲水性物质的分配产生较大影响同一聚合物的疏水性随分子量的增加而增加当分子量增加时在质量浓度不变的情况下其两端羟基数目减少疏水性增加亲水性的蛋白质不再向富含相中聚集而转向另一相体系中无机盐离子的影响双水相萃取菠萝蛋白酶的工艺研究在无机盐体系中无机盐离子在两相中有不同的分配因此在两相间形成电位差由于各相要保持电中性这对带电生物大分子产生很大影响体系的影响会影响蛋白质可离解基团的离解度因而改变蛋白质所带电荷和分配系数另外还影响系统缓冲物的离解程度体系温度的影响温度影响相图同时影响分配率和蛋白质的生物活性一般的临近点附近温度对分配率的影响较大远离临近点时影响较小体系中微生物的影响对于同一种双水相体系微生物也会影响体系上下相的比例以及胞内蛋白质在体系中的分配系数菠萝蛋白酶在双水相体系中的萃取原理双水相萃取技术分离提纯生物物质是基于被分离组分在两相间的选择性分配其分配行为可由表观分配系数来描述式中分别为上相和下相分配物质的浓度单位为双水相萃取操作中目标产物的回收率可用下列公式计算式中为上下相的体积比其中分别代表溶质在上相下相中的浓度单位为如果菠萝蛋白酶主要分配在上相菠萝蛋白酶酶的相回收率按下列公式计算其中如果菠萝蛋白酶主要分配在下相其相回收率按下列公式计算论文研究的主要内容本文主要研究从菠萝下脚料中提取菠萝蛋白酶的实验选定了体系来进行双水相法提取菠萝酶的工艺研究通过实验以不同的分子量溶液浓度溶液浓度外加盐的种类及浓度对萃取菠萝酶以及菠萝蛋白酶含量的影响通过对体系上下相的酶活的测定对相比表观分配系数酶活性回收率等参数的计算后作图双水相萃取菠萝蛋白酶的工艺研究经分析后选择合适的体系调节和的比例及浓度测定蛋白质的含量分析各因素对体系萃取菠萝酶以及蛋白质含量的影响得出双水相体系萃取菠萝酶的最优工艺条件为双水相技术在分离纯化菠萝酶中的应用提供理论依据材料与方法双水相萃取菠萝蛋白酶的工艺研究实验材料材料菠萝下脚料广东黄登菠萝甲醛分析纯中国医药集团上海化学试剂公司分析纯天津市大茂化学试剂厂分析纯天津市大茂化学试剂厂分析纯天津市大茂化学试剂厂分析纯天津市大茂化学试剂厂分析纯天津市大茂化学试剂厂明胶分析纯莱阳市康德化工有限公司分析纯莱阳市康德化工有限公司设备超声清洗仪江苏省昆山市曙峰企业电热恒温水浴锅北京市长凤仪器仪表公司高速离心机北京医用离心机厂组织捣碎机上海比朗仪器有限公司紫外分光光度计龙尼柯仪器有限公司实验方法双水相体系的确定常见的双水相体系是高聚物高聚物或盐体系在酶的分离纯化中最常见的体系是聚乙二醇葡聚糖由于葡聚糖成本较高因此选定聚乙二醇盐体系作为研究对象但由于体系研究的相对成熟且成本相对低对工业应用具有很大意义因此在本实验中选定作为提取菠萝酶研究体系相图的绘制相图是研究双水相萃取的基础双水相形成条件和定量关系常用相图来表示图双水相萃取菠萝蛋白酶的工艺研究是典型的高聚物高聚物水双水相体系的直角坐标相图两种聚合物以适当比例溶于水就会分别形成有不同组成的两相上相组成用点表示下相组成用点表示曲线称为双节线直线称为系线双节线上方是两相区下方为单相区所以组成在系线上的点分为两相后其上下相组成分别为和量的多少服从相图的杠杆定律图水双水相体系相图操作步骤准确称取一定质量的液体于大试管中按表所列第列数据加入去离子水用滴定管缓慢滴加已配好的的盐溶液并不断在搅拌混合观察溶液的澄清程度直至试管内液体出现浑浊为止记录盐溶液的加量然后按表格所列第列数据加入水溶液澄清继续向试管中滴加盐溶液并不断混匀直至再次达到浑浊如此反复操作计算每次达到浑浊时和盐在系统总量中的质量分数将实验数据填入表中以的质量分数为纵坐标某种盐的质量分数为横坐标作图即得到一条双节线的相图表相图制作表双水相萃取菠萝蛋白酶的工艺研究编号水溶液加量纯累计量溶液累计总量质量分数质量分数根据表数据以质量分数为横坐标以质量分数为纵坐标即可做出相图蛋白标准曲线的绘制考马斯亮蓝是一种染料在游离状态下呈红色当与蛋白质结合后会变为青色蛋白质含量在范围内蛋白质色素结合物在下的吸光度与蛋白质含量成正比可用比色法测定取只具塞试管编号后按下表加入试剂盖上塞子摇匀放置两分钟后在波长下比色测定以牛血清蛋白含量作为横坐标以吸光度作为纵坐标绘出标准曲线表蛋白含量标准曲线制作表管号蛋白标准液蒸馏水考马斯亮蓝蛋白质含量经过实验测得吸光度作图如图双水相萃取菠萝蛋白酶的工艺研究图蛋白质含量标准曲线菠萝粗酶的提取本实验采用超滤浓缩法提取菠萝粗酶称取一定质量的菠萝下脚料按加入蒸馏水用组织捣碎机将其榨成汁用三层滤布过滤弃去残渣并收集上清液置于烧杯中静置十分钟使其澄清取澄清液将上清液倒于大离心管离心十分钟弃去上清液将沉淀转移至小烧杯中置于超声清洗仪中进行浓缩将浓缩后的菠萝蛋白酶放在装有的干燥器中干燥即得到菠萝粗酶双水相体系的建立将不同相对分子质量的和配制成一定浓度的溶液准确称取一定量溶液加入到试管中然后加入溶液混合至试管内开始出现混浊为止离心分离成相即可得到体系根据加入的溶液的量算出和及水在系统中的质量百分浓度双水相萃取操作方法将提取的菠萝粗酶称取配制成一定浓度的酶溶液备用按比例准确称取一定量的和于带刻度的离心管中加入粗酶液混合均匀后调平静置离心读取上下相体积及总体积用注射器分别取上下相分别定容至测其酶活力及蛋白酶含量测原酶液酶活力用移液管吸取菠萝粗酶液定容至测其酶活力为原酶液酶活力方法如测蛋白酶的含量用移液管吸取菠萝粗酶液定容至测其酶双水相萃取菠萝蛋白酶的工艺研究活力为原酶液蛋白酶含量方法如菠萝蛋白酶酶活测定法菠萝蛋白酶活性计算公式为酶活酶活力测定步骤消化移取明胶底物溶液于锥形瓶中将底物溶液置于水浴中调节温度至加人酶溶液不停地搅拌此溶液经过分种消化后加入滴过氧化氢溶液然后借助计用的溶液将其值调至再加入浓度为的甲醛溶液滴定用的标准溶液滴定至溶液时为终点这时读取标准溶液的消耗量即为主值空白对照将底物溶液先置于水浴中经过分种消化后加滴过氧化氢溶液再加人酶溶液其它步骤同主值的测定方法最后读取标准溶液的消耗量即为空白值结果与分析双水相萃取菠萝蛋白酶的工艺研究每菠萝下脚料中含有的菠萝蛋白酶含量及菠萝蛋白酶的活性利用法测定菠萝蛋白酶粗品的活性为由于酶的活性容易受到影响因此在提取过程中各种操作条件都会影响到酶的活性在榨汁过程中局部温度过高会使酶得活性降低超声清洗仪中的温度要设置合适过高会使酶失活将提取的菠萝粗品置于冰箱中低温密封保存以备后续试验待用取菠萝酶粗品利用步骤测得吸光度经查图的蛋白标准曲可知每菠萝下脚料中含有的的蛋白酶含量为不同分子量的体系相图的制作体系的相图是一条双结线双结线的位置和形状与相对分子质量有关查资料可得相对分子量质量越高相分离浓度越低体系中不同分子量的相图如图至图图体系相图双水相萃取菠萝蛋白酶的工艺研究图体系相图图体系相图双水相萃取菠萝蛋白酶的工艺研究图体系相图图体系相图从图图至图中可以看出不同分子量的溶液构成的双水相体系其临界分相浓度有很大差别在图中可以看出分子量越大分相临界点越小相分离所需的浓度越低两种聚合物相对分子质量相差越大双节线的形成越不对称成相物质浓度较少时即可分相分相容易任何在同一系线上的组成但分相后两相的组成相同但两相的量不同两相的量可按杆杠原理计算而在图和图中可以看出随着分子量的增大相分离所需的浓度越低两种聚合物相对分子质量相差越大双节线的形状越不对称可能因为双节线的位置和形状与聚合物的相对分子质量双水相萃取菠萝蛋白酶的工艺研究有关物质在两相中的分配受表面自由能和表面电荷的影响更多的特征有待进一步研究的分子量对菠萝蛋白酶的分配系数相比及酶活回收率的影响用不同分子量的构造双水相体系在各双水相体系中成相组分质量分率相同其他实验条件室温相同按实验操作步骤测定菠萝蛋白酶在构造的双水相体系中的分配系数和酶活性回收率结果如图图的分子量对的影响从图可以看出随着分子量增加分子内极性基团如羟基等的比重相对较低从而会导致极性程度减小其亲水性基团比重相应减少其憎水性程度增强因此与间的憎水性程度差距拉大增加了相界面张力临界浓度降低相界面张力增加不利菠萝蛋白酶的分配到相当分子量较小时表观分配系数较大所需要的的浓度也较高综合以上分配方面和操作各方面的影响确定和的双水相体系酶活回收率能达可作为菠萝蛋白酶的分离体系且综合双水相体系的易于放大等优点可应用到工业生产当中在体系中菠萝酶分配在下相中因此选择和的双水相体系通过测吸光度进行蛋白质含量的测定经计算可知蛋白酶的含量为双水相体系中浓度相同的情况下随着分子量的增大菠萝蛋白酶的表观分配系数逐渐减小上相的酶活性回收率也降低相比也逐渐减小由于的分子量增大菠萝蛋白酶趋向于分配到下相中分子量越小菠萝蛋白酶越趋向分配于上相中双水相萃取菠萝蛋白酶的工艺研究因此当分子量增大时上相的体积增大以至于上相的酶活性回收率降低同时随着的分子量增大相粘度也逐渐增大使得成相物质受空间阻力不利于分配到相中菠萝蛋白酶易于分配到下相中在相中可进行脱盐等操作提取菠萝酶精品浓度对菠萝蛋白酶的分配系数相比及酶活回收率的影响用不同浓度的构造双水相体系在各双水相体系中成相组分质量分率相同其他实验条件室温相同按实验操作步骤测定菠萝蛋白酶在构造的双水相体系中的分配系数和酶活性回收率结果如图图浓度对的影响从图可以看出当浓度一定时随着浓度的增大菠萝蛋白酶的表观分配系数逐渐增大酶活性回收率也增大相比逐渐减小但浓度大于时菠萝蛋白酶的表观分配系数减小当体系的浓度太高时会发生盐析作用因此酶活回收率也降低改变成相物质在双水相体系中的总浓度实际上是改变了操作的加料点从双水相的相图可知体系中成相物质的总浓度增加时体系将远离临界点同时系线长度增加两相性质的差别增大对一定分子量的相浓度增加时其中的亲水性基团数目也增加相比增加所以菠萝蛋白酶的分配系数增加酶活回收率也同时增加增加双水相体系中的浓度对分离是有利的但如果浓度太高一方面成相物质用量会增加成本也增加另一方面浓度增加相比减小粘度增大上相体积增大对酶的浓缩不利影响酶活回收率研究表明浓度过高体积排阻效应增大导致目的蛋白在相间的传递和在相中的扩散阻力大大增加双水相萃取菠萝蛋白酶的工艺研究不利于蛋白酶进入相综合考虑选择的浓度为当的浓度为时通过测吸光度进行蛋白质含量的测定经计算可知蛋白酶的含量为浓度对菠萝蛋白酶的分配系数相比及酶活回收率的影响在的浓度不变时改变的浓度构造双水相体系其他实验条件室温相同按实验操作步骤测定菠萝蛋白酶在构造的双水相体系中的分配系数和酶活性回收率结果如图图浓度对的影响从图可以看出当浓度一定时随着浓度的增加体系中的盐析作用会增强菠萝蛋白酶趋向分配于上相因此菠萝蛋白酶的表观分配系数逐渐减小而且当浓度增大到一定值时菠萝蛋白酶会部分析出另外从相图可知浓度增加相体积会减少相比降低加上盐析作用的酶活损失酶活回收率降低所以用量是不易过大的既达不到提纯的目的还会造成原料的浪费在本实验条件下的浓度为比较适宜在此条件下通过测吸光度进行蛋白质含量的测定经计算可知蛋白酶的含量为外加盐浓度的不同对菠萝蛋白酶的分配系数相比及酶活回收率的影响在双水相体系中加入外加无机盐其阴阳离子在两相的分配是不同的同时由于电中性的约束会在两相产生电位差同时两相中的带电离子也会影响被分配物质分子的带电性使被分配物质分子加电和电性中和从而影响到被分配物质的疏水性结果如图双水相萃取菠萝蛋白酶的工艺研究图浓度对菠萝蛋白酶的影响从图中可以看出在双水相中加入外加盐如等菠萝蛋白酶的分配系数和上相酶活回收率随外加盐的浓度增大都降低相比也逐渐降低可能是由于在该双水相体系中易分配在相增加了相的正电性而菠萝蛋白酶在时呈正电性因此不利于菠萝蛋白酶进入相外加盐对菠萝蛋白酶在本双水相体系的影响作用是复杂的有待进一步研究而加入和能明显使菠萝蛋白酶活性降低在本实验的条件下外加盐对菠萝蛋白酶的分配是不利的讨论在双水相系统中有许多因素会影响分配系数及酶活回收率包括系统本身的因素如双水相的系统组成聚合物分子量聚合物浓度外加盐和离子强度等以及目标产物的性质如疏水作用电荷分子量等同时实验的操作过程中的实验误差也会影响到实验结果尽管目前对聚合物溶液浓度热力学引起的生物大分子在两相间不规则扩散双水相萃取菠萝蛋白酶的工艺研究的机理还不清楚还没有相应的理论指导设计特定生物大分子的分配系统但是利用双水相技术特有的有点是可以获得特定生物大分子最适宜分离的相系统通过大量实验研究表明双水相可以用于工艺生产当中用于酶的分离提取经过脱盐等操作可以得到酶的精品在实际生产当中具有重要的意义经过大量实验研究表明双水相体系是提取纯化菠萝酶的较优体系通过多次试验得出最佳工艺在该双水相体系中菠萝蛋白酶分配系数随分子量的增大而降低实验表明最适分子量为增加的浓度菠萝蛋白酶的分配系数和酶活回收率都增加得出溶液最适浓度为增加体系中的的浓度开始时菠萝蛋白酶的分配系数增加但超过时由于盐析作用会使其分配系数下降酶活回收率也会随增加而降低选择溶液浓度为外加盐对分配系数及酶活回收率的影响因素比较复杂由于实验时间和条件的限制本实验只分析了个因素对表观分配系数及酶活回收率的影响其实影响双水相萃取的因素比较复杂在实际生产当中可以通过多种调节手段来提高酶的选择性或回收率利用这种温和的萃取方法不仅有利于保护目的物质的生物活性而且目的蛋白的的率高纯度高因此在工业生产中有很大的发展前景今后实验可以进一步研究加入的酶浓度及体积和值及其他因素对双水相萃取的影响力求摸索出最佳工艺应用于工业中参考文献王平诸提取菠萝蛋白酶工艺食品与机械王志华马会民马泉莉等双水相萃取体系的研究应用化学双水相萃取菠萝蛋白酶的工艺研究严希康生化分离工程北京化学工业出版社郭黎平傅冬梅张卓勇等双水相萃取技术的研究进展东北师大学报自然科学版李丽敏氨基酸在乙醇磷酸氢二钾双水相体系中分离行为的研究东北师范大学辜鹏谢放华双水相萃取技术的研究现状与应用化工技术与开发李夏兰王丽娜用双水相从缪液萃取菠萝蛋白酶华侨大学学报自然科学版毛忠贵生物工业下游技术中国轻工业出版社致谢本文是在谭海刚老师悉心指导下完成的在整个论文研究工作过程中始终得到谭老师大力鼓励无私帮助和卓有成效的指导从论文的选题到最后毕业论文的定稿都倾注了谭老师大量的心血谭老师多次询问研究进程并为我指点迷津帮助我开拓研究思路精心点播并给予我很大的鼓励谭老师渊博宽广的知识严谨务双水相萃取菠萝蛋白酶的工艺研究实的治学态度以及积极乐观的人生观使我受益匪浅在此我谨向导师谭老师表示衷心地感谢和最崇高的敬意实验过程中非常感谢于翠芳老师张名爱老师以及实验室师姐们的热情帮助正是由于他们使我在各方面取得显著的进步在此我向他们表示我诚挚的谢意在此也要特别感谢和我同一实验室做论文的同班同学在整个实验过程中非常感谢他们对我的帮助以及鼓励使得本课题顺利的进行特此感谢于原原同学丁晓庆同学韩艳艳同学在此表示对以上对我带来帮助的老师和同学衷心的感谢我要特别感谢我的家人感谢我的父母为我提供了优良的生活和学习环境感谢他们为我付出的一切最后祝所有的老师培养出越来越多的优秀人才桃李满天下