生物工程—猪源双歧杆菌发酵工艺的研究.doc

毕业设计论文猪源双歧杆菌发酵工艺的研究学院化工与材料学院专业姓名指导老师生物工程任妍菲学号职称周新明高级工程师中国珠海二一年五月北京理工大学珠海学院毕业论文诚信承诺书本人郑重承诺我所呈交的毕业论文猪源双歧杆菌发酵工艺的研究是在指导教师的指导下独立开展研究取得的成果文中引用他人的观点和材料均在文后按顺序列出其参考文献论文使用的数据真实可靠承诺人签名日期年月日北京理工大学珠海学院届本科生毕业论文猪源双歧杆菌发酵工艺的研究摘要双歧杆菌是人体内存在的一种生理性细菌是人体有益菌中最值得重视和研究的一种它与人体的健康密不可分可以说是大自然赐予人类的健康法宝双歧杆菌的研究和生产具有很好的发展前景双歧杆菌一般能从动物身上提取猪的胃上皮细胞黏膜附有有大量双歧杆菌从猪的粪便中分离出双歧杆菌并将其扩大生产合适的生长条件对双歧杆菌的生长速度菌体形态活菌数代谢产物有良性的影响因此通过研究获得双歧杆菌生产的最优工艺方案有非常重要的意义关键词双歧杆菌发酵工艺北京理工大学珠海学院届本科生毕业论文北京理工大学珠海学院届本科生毕业论文目录摘要引言研究背景研究单位简介双歧杆菌的作用改善人体肠道功能恢复人体菌群平衡形成抗菌生物屏障维护人体健康控制人体内毒素的水平保护肝脏病增强肝脏的解毒排毒功能降血脂作用防止动脉硬化个高血压免疫调节作用营养作用提高酶活力消除人体自由基抗肿瘤预防癌症研究意义双歧杆菌开发现状双歧杆菌因子的开发与应用双歧杆菌营养液新型酸奶的开发与应用北京理工大学珠海学院届本科生毕业论文双歧杆菌药品的开发双歧杆菌生物工程展望材料样品来源主要实验试剂主要仪器与设备双歧杆菌的分离和鉴定实验方法分离纯化方法厌氧培养仔猪肠道双歧杆菌的初步鉴定本章小结仔猪肠道双歧杆菌的生长特性研究操作方法试验方法检测方法培养温度起始培养基的选定碳源氮源生长因子北京理工大学珠海学院届本科生毕业论文测定双歧杆菌的生长曲线本章小结双歧杆菌发酵工艺条件的优化研究双歧杆菌制剂的生产工艺流程发酵方案的确定厌氧发酵培养基组成及发酵条件的确定厌氧发酵的培养基组成发酵控制条件发酵液活菌数的检测发酵罐扩大培养试验发酵罐扩大培养试验本章小结结论与展望结论展望参考文献附录培养基的配置附录双歧杆菌的糖代谢途径谢辞北京理工大学珠海学院届本科生毕业论文引言研究背景双歧杆菌属归属于放线菌门放线菌纲科里氏杆菌亚纲双歧杆菌目双歧杆菌科双歧杆菌是人体内存在的一种生理性细菌是人体有益菌中最值得重视和研究的一种它与人体的健康密不可分可以说是大自然赐予人类的健康法宝于年和年首先描述了分离自哺乳婴儿粪便的一种革兰氏阳性弯曲和常见分叉的杆菌命名为两歧双歧杆菌双歧杆菌的细胞形态呈现多种多样有短杆较规则或纤细状带有尖细末端的细胞有呈球形的也有长而稍弯曲的或呈各种分支或分叉形棍棒状或勺形单个或链状形栅栏形排列或聚集成星状革兰氏染色阳性不抗酸专性厌氧无芽孢荚膜或鞭毛不运动触媒隐形硝酸盐还原阴性靛基质阴性明胶液化阴性精氨酸水解阴性最适生长温度初始生长最适发酵葡萄糖产生乳酸和醋酸到目前为止已报道的双歧杆菌有个种主要有青春双歧杆菌长双歧杆菌两歧双歧杆菌精华双歧杆菌短双歧杆菌乳酸双歧杆菌婴儿双歧杆菌侧芽双歧杆菌等它们主要栖居于人体和动物的肠道反刍动物的瘤胃小肠上部几乎检测不出小肠下部数量可达大肠粪便中可达此外在人的牙齿缝穴和阴道以及污水中也有双歧杆菌栖居许多动物如鸡猪犬小鼠地鼠狼猴家兔牛羊马甚至蜜蜂的肠道中都有双歧杆菌属并且大都以优势菌群存在除齿双歧杆菌可能是病原菌外其他种尚无致病性的报道在婴儿出生后天肠道内即建立起以双歧杆菌占绝对优势的菌群它们发酵糖类产生大量的乙酸和乳酸抑制了具有潜在致病性的大肠杆菌等的生长繁殖之间达到肠道微生态的平衡这种平衡状态下的肠菌群对婴幼儿的营养代谢抗感染及生长发育具有重要意义双歧杆菌在成年人的肠道中仍然发挥着重要的生理作用可以起到调整肠菌群失调治疗肠功能紊乱抗肿瘤等重要作用并且还可以起到延年益寿的功效天然的双歧杆菌菌种可以从动物中分离猪的胃上皮细胞粘膜附有乳酸菌大肠杆菌和酵母菌大肠内含乳杆菌和双歧杆菌的数量可达每克内容物一亿到十亿个本研究中使用的猪源双歧杆菌就是从健康仔猪的粪便中分离纯化而得的猪源双歧杆菌具有活性高增值能力强有一定的氧耐能力研究单位简介北京理工大学珠海学院届本科生毕业论文广州市微生物研究所是广州市科技和信息化局直属的科研机构主要从事微生物发酵生物医药食品添加剂防霉防虫和食用菌等领域的技术研究与产品开发经认定批准为广州市高新技术企业发展定位以微生物发酵为主体以产品开发和技术服务为两翼本所成立于年原址位于广州市宝岗大道荔福路号地处海珠区中心位置交通便利占地面积多平方米建筑面积多平方米新址位于广州科学城占地面积多平方米一期建筑面积多平方米本所拥有中高级职称专业技术人员近人初级职称专业技术人员人拥有超低温冰箱冷冻干燥机冷冻离心机以及发酵罐等一批先进的仪器设备三十多年来承担各类科研项目多项先后有多个科研项目获得省部和市级的奖励双歧杆菌的益生作用改善人体肠胃道功能双歧杆菌可治疗因大量使用抗生素而导致的伪膜性肠炎有人采用双歧杆菌制剂治疗伪膜性肠炎例临床副作用和复发率均明显降低双歧杆菌可治疗便秘双歧杆菌将糖分解后生成乳酸和醋酸使肠道呈酸性其结果能控制由有害菌引起的异常发酵并且刺激肠蠕动起到解除便秘的作用双歧杆菌可治疗慢性腹泻通过双歧杆菌对慢性腹泻患者临床观察研究表明在服药两周以后患者大便次数形状正常临床症状消失其总有效率为复发率低许多国内医院已将双歧杆菌制剂作为治疗慢性腹泻的首选药物恢复人体菌群平衡形成抗菌生物屏障维护人体健康某些内源性菌群主要是革兰氏阳性杆菌和球菌与肠粘膜密切结合在肠粘膜的某些部位形成一层称为膜菌群而条件致病性的兼性厌氧菌则存在于肠腔中双歧杆菌通过磷壁酸于肠黏膜上皮细胞相互作用密切结合于其他厌氧菌一起共同占据肠粘膜表面形成以个生物学屏障构成肠道的定植抗力阻止致病菌条件致病菌的定植和入侵双歧杆菌在维持正常的肠蠕动方面具有重要作用而正常的肠蠕动是阻止致病菌在肠道定植的一个重要手段如使用蠕动抑制剂后再感染痢疾杆菌可造成致命的后果无菌动物肠道的蠕动运送和排空能力均较弱肠腔内偏碱性较高在普通动物肠道中由于双歧杆菌等专性厌氧菌产酸肠腔内处于酸性环境较低具有调节肠道正常蠕动维持生理功能的作用对致病菌的拮抗作用也是双歧杆菌构成生物屏障的一个重要因素试管内试验证实它对痢疾杆菌伤寒杆菌乙型副伤寒杆菌变形杆菌致病性大肠杆菌产期荚膜梭菌绿脓杆菌葡萄球菌以及对某些真菌如白色念珠菌具有拮抗作用其机理主要是双歧杆菌发酵糖产生大量醋酸与乳酸降低和抑制致病菌生长此外双歧杆菌还产生细胞外糖苷酶可以降解肠粘膜上皮细胞的复杂多糖由于这些糖是潜在致病菌的受体也是结合细菌毒素的受体所以通过这种酶的作用可以阻止潜在致病北京理工大学珠海学院届本科生毕业论文菌及其毒素对肠粘膜上皮细胞的粘附控制人体内毒素的水平保护肝脏病增强肝脏的解毒排毒功能人体肠道的有害菌产生并释放毒素进入血液中对于肝脏会产生很严重的损伤双歧杆菌制剂可以以致产生毒素的有害菌数量从而对肝脏患者起到良好的治疗作用家国内大型医院采用双歧杆菌制剂对例慢性肝炎患者进行周治疗发现患者肝功能明显改善双歧杆菌还可以用于治疗肝昏迷并可以抑制乙肝病毒促进大三阳小三阳转阴降血脂作用防止动脉硬化和高血压人体血液中胆固醇含量高会导致动脉硬化和高血压的产生双歧杆菌等有益菌可以影响胆固醇的代谢将其转化为人体不吸收的类固醇降低血液中胆固醇的浓度因而对高血压和动脉硬化有一定的防治作用免疫调节作用双歧杆菌具有免疫调节作用双歧杆菌能激活机体吞噬细胞的吞噬活性提高抗感染能力提高人体抵抗力有缓解失眠易疲劳或疲劳后难以恢复易生病等亚健康状况营养作用牛乳具有丰富的营养是老年人和婴儿良好的食品但是中国人中有相当一部分缺乏乳糖酶不能分解牛乳中的乳糖这些人饮用牛乳后常常会出现胃肠功能紊乱导致胃肠痉挛胀气或腹泻迫使这一人群不能饮用牛乳从而放弃了牛乳中的其他重要成分而双歧杆菌在乳制品发酵过程中可以产生乳糖酶帮助患者消化乳糖乳糖酶缺乏者饮用经双歧杆菌发酵的乳制品就既可以获得牛乳中丰富的营养又免受胃肠道病痛之苦双歧杆菌在人体肠内发酵后可产生乳酸和醋酸能提高钙磷铁的利用率促进铁和维生素的吸收双歧杆菌发酵乳糖产生的半乳糖是构成脑神经系统中脑苷脂的成分与婴儿出生后脑的迅速生长有密切的关系双歧杆菌可以产生维生素维生素维生素维生素及丙氨酸缬氨酸天冬氨酸和苏氨酸等人体的必需营养物质对于人体具有不容忽视的重要营养作用提高酶活力消除人体自由基双歧杆菌可以提高酶活力消除人体自由基具有抗衰老延年益寿的作用欧美和日本的微生态学家调查表明长寿老人粪便中的双歧杆菌数量与中青年相当我国科学家对广西巴玛地区长寿老人的调查也得了相同的结果双歧杆菌抗衰老的原因是因为双歧杆菌能抑制腐败菌生长减少其代谢产物中的氨硫化氢吲哚及粪臭素等有害物质的生成双歧杆菌与一般的药品不同一般药品是单向治疗例如降血压降血脂治腹泻北京理工大学珠海学院届本科生毕业论文治便秘等其作用是单向的二而双歧杆菌直接的作用是双向调整的即可将高的降下来也可将低的升上去使用双歧杆菌制剂可以同时治疗腹泻和便秘使人体恢复正常这就是调整的作用抗肿瘤预防癌症将大肠杆菌粪链球菌及两株腐败梭菌的特定菌与无菌小鼠肠联后造成的小鼠发生肝肿瘤若上述四株菌再加上肠双歧杆菌与无菌小鼠肠联后则使肝肿瘤发生率将由下降到上述实验说明肠道内某些细菌可以产生致癌因子而另外一些细菌如双歧杆菌可能具有清除这些致癌因子的能力双歧杆菌还具有降解亚硝胺的作用双歧杆菌除降解致癌因子抑制肿瘤发生外还对已形成的肿瘤具有抑制作用康白报告青春双歧杆菌对小鼠肿瘤有抑制作用对小鼠艾氏腹水癌有抗癌活性将瘤细胞接种小鼠于后经尾静脉注射一定量青春双歧杆菌活菌每一次连续对照组注射生理盐水自接种瘤细胞后处死平均瘤重试验组与对照组有非常显著差异不仅活菌具有抗肿瘤作用而且死菌也有作用报告加热杀死的婴儿双歧杆菌的细胞壁具有抗肿瘤作用作用的强弱与细胞壁的完整性有关完整的比受到破坏的细胞壁作用强抗肿瘤的机理是通过激活吞噬细胞的吞噬活性而不具有直接的细胞毒作用研究意义近年来各国科学家对双歧杆菌的研究逐渐深入发现了它与肠道生理共生菌的一些新功能并迅速在食品和医药工业中进行生物工程开发取得了令人瞩目的进展双歧杆菌开发现状双歧杆菌因子的开发与应用微生物学家在研究肠道生理菌体外培养时发现一些物质能显著促进双歧杆菌的生长所以称双歧因子这些物质计有双歧困子人的初乳双歧因子多肽及次黄嘌呤胡萝卜双歧因子和寡糖类双歧因子寡糖类双歧因子是一些不同类型的低聚寡糖机体和一些有害细菌不能利用但能促进双歧杆菌和一些乳酸菌的生长有低聚半乳糖低聚果糖低聚葡萄糖等几十种临床给病人服用低聚果糖每日周后每克粪便中的双歧杆菌数由增至病人的消化能力和健康状况大为改善成人每天服用低聚葡萄糖天后肠内的双歧杆菌增加倍双歧因子除初乳外大多为多糖的水解产物生产工艺简单成本低廉是社会效益和经济效益很大的保健品双歧杆菌营养液北京理工大学珠海学院届本科生毕业论文针对双歧杆菌营养保健助消化抗癌抗衰老的生理功能将其制成保健营养品参加保健营养品市场角逐成了保健食品厂家增加利润的又一目标各种牌号的双歧饮料表明我国对肠道生理菌的开发应用已向世界水平靠近新型酸奶的开发与应用传统的酸奶大多采用从自然界分离的菌种微生物学家对肠道生理细菌功能的再发现促成了酸奶生产的革命现在许多国家生产酸奶已采用从人体分离得到的双歧杆菌嗜酸乳杆菌和肠球菌作菌种进行发酵再配以其他辅料生产出营养价值高风味独特的新型乳品如美日欧洲的强化酸奶低钠酸奶糖化酸奶果味酸奶大豆酸奶什锦酸奶等我国北京上海等地的乳品厂也生产出各式新型酸奶内蒙古还生产出双歧杆菌奶粉由于这些酸奶用肠道生理菌发酵配置科学不但口感好老少皆宜而且营养价值比传统酸奶高出许多被称为世纪的发酵奶增智益寿的疗效食品双歧杆菌药品的开发由于双歧杆菌对人体有其独特的生理功能许多国家都在进行双歧杆菌药品的开发我国一些科研单位和大专院校研制出不同类型的活菌体制剂并按照药品卫生标准对菌株指数毒性杂菌含量包装等进行了系统研究初步完善了生产工艺由于活菌体在包装后仍要繁殖又对贮存最佳条件有效期进行了研究现正在完成双歧杆菌乳酸杆菌活菌体药品标准及使用规范双歧杆菌生物工程展望对双歧杆菌和肠道乳酸杆菌生理功能的再认识和开发研究是世纪生物工程在微生物开发应用上的一大成果它再一次雄辩地证明了科学技术是第一生产力目前我国科学家正加紧对肠道生理菌的普查和遗传研究以尽快赶上先进国家水平今后双歧杆菌生物工程开发研究的主要目标是一进一步搞清双歧杆菌的抗性和定植机理抗感染抗肿瘤抗衰老是双歧杆菌及某些肠道乳酸杆菌的重要生理特性但目前对其机理只有初步的了解进一步搞清三抗机理可为深层开发利用奠定理论基础双歧杆菌和乳酸杆菌只有在肠道定植才能发挥作用但定植有种的特异性也与肠道微环境相关寻找选育高定植菌种和最佳定植条件也是今后双歧杆菌生物工程的重要任务二选育优良菌种选育优良菌种是今后研究的重要方面新的系列菌种应具备抗噬菌体产酸耐酸繁殖快耐氧性好存活力强抗药等优良特性才能更好地发挥生产应用价值和定植后的功能三开发新的生长因子世界上已生产了几十种双歧杆菌生长因子我国才开发数种产量也不高今后应采用酶工程技术充分利用我国农副产品生产更多的双歧杆菌生长因子北京理工大学珠海学院届本科生毕业论文四用基因工程改造菌种把特种营养合成基因如氨基酸抗药基因激素基因抗衰老基因等转移到双歧杆菌中培养出新菌种并克隆化是双歧杆菌生物工程的尖端课题必须组织力量攻克双歧杆菌在保健和医疗方面都有很好的作用效果因此双歧杆菌产品有很好的经济效益双歧杆菌发酵生产是双歧杆菌产品生产的前提双歧杆菌的最适生长温度初始生长最适温度过低菌生长增殖缓慢温度过高菌容易衰老双歧杆菌的合成和代谢作用都受到酶催化调控酶只有在合适的环境下才能正常的发挥催化作用过高或过低都会引起菌代谢紊乱另外双歧杆菌对培养基的成分有选择性适合的培养基能促进双歧杆菌的生长和代谢合适的发酵条件能促进菌生长缩短生产周期节约成本提高产量减少生产事故因此通过研究收集双歧杆菌在不同环境下的生长数据选择出双歧杆菌发酵生产的最优方案对于生产管理和经济收益都是有重要意义的北京理工大学珠海学院届本科生毕业论文材料样品来源本实验分离样品来源于广州市良种猪场和日龄的健康小猪粪便主要实验试剂硫酸新霉素盐酸半胱氨酸葡萄糖大豆蛋白胨胰蛋白胨酵母浸出膏牛肉浸膏番茄汁琼脂吐温乳糖可溶性淀粉低聚果糖麦芽汁培养基营养肉汤培养基氯化钠氯化钙氯化铁硫酸镁乙酸钠等无菌纯化水注射用蒸馏水主要仪器与设备超净工作台生化培养箱厌氧培养箱干燥器压力蒸汽消毒器移液枪精密计电子天平显微镜烘箱离心机旋涡混合器可见光分光光度计电热恒温培养摇床超低温冰箱升发酵罐升发酵罐北京理工大学珠海学院届本科生毕业论文双歧杆菌的分离和鉴定实验方法分离纯化方法样品稀释后取涂培养基配置见附录平皿上按厌氧培养长出单菌落后逐个进行革兰氏染色和芽孢染色挑选无芽孢杆状且有和形分支的菌株再稀释涂平皿按以上方法重复次得到纯菌株后用平皿保存厌氧培养本实验采用在干燥器中将烛缸法与焦性没食子酸法相结合的厌氧方法利用蜡烛燃烧耗尽干燥器内的氧气和焦性没食子酸在碱性溶液内能大量吸氧的原理进行厌氧培养每空间用焦性没食子酸氢氧化钠具体做法是将溶于水中置干燥器内点燃干燥器内蜡烛后在溶液中加入焦性没食子酸盖上涂有凡士林密封干燥器盖子蜡烛耗尽氧气熄灭后将干燥器置培养箱中经实验我们从和日龄健康仔猪粪便中分离纯化出株双歧杆菌仔猪肠道双歧杆菌的初步鉴定经形态学及生理生化特性的初步鉴定对分离驯化选育得到的两株猪源菌种猪源菌种进行了生理生化特性的初步鉴定试验结果见表及表表双歧杆菌糖发酵实验结果菌株木糖纤维二糖核糖半乳糖果糖乳糖麦芽糖淀粉糊精鼠李糖甘露醇葡萄糖山梨醇蔗糖水杨素阿拉伯糖猪源菌种1猪源菌种2北京理工大学珠海学院届本科生毕业论文表双歧杆菌属内种的生理生化特征表菌名核糖阿拉伯糖乳糖纤维二糖山梨醇淀粉麦芽糖木糖果糖半乳糖蔗糖甘露醇水杨苷球双歧杆菌注阳性反应阴性反应某些菌株阳性从表结果可知猪源菌种猪源菌种不产生过氧化氢酶甲基红试验阳性不产生吲哚脲酶试验阴性不分解尿素不产生硫化氢不液化明胶不还原硝酸盐精氨酸产氨试验阴性发酵葡萄糖产酸不产气符合双歧杆菌特性糖发酵实验结果见表与双歧杆菌属内种的生理生化特征表中短双歧杆菌特性见表符合初步判断其为短双歧杆菌属因此初步鉴定猪源菌种猪源菌种均为双歧杆菌属菌通过上述对分离筛选到的猪源肠道益生菌进行驯化选育获得适用于产业化的益生菌经初步鉴定后把获得的种猪源双歧杆菌送省微生物研究所进行了精确的鉴定鉴定结果为猪源菌种为双歧杆菌猪源菌种为双歧杆菌这些菌种遗传性能稳定适用于产业化发酵生产本章小结用培养基可从健康仔猪粪便中分离得到双歧杆菌双歧杆菌是一种对氧敏感的厌氧细菌但经过驯化的双岐杆菌具有一定的氧耐受性能在微氧环境下繁殖适合于实际发酵生产北京理工大学珠海学院届本科生毕业论文仔猪肠道双歧杆菌的生长特性研究操作方法试验方法将菌种液猪源菌种猪源菌种接入装有培养液的三角瓶中控制单一变量实验组在温度值培养基相同的条件下摇床培养小时再对发酵液进行测定每个实验组做个平行测定测定方法接种培育小时后取发酵液经过倍稀释用分光光度计在处测定吸光度一组个数据求得平均值绘制出生长特性曲线培养温度温度是乳酸细菌生产培养的重要条件之一微生物的生长与产物的形式都是在各种酶的催化下完成的温度是保证酶活性的重要条件因此在培养中必须保持稳定而合适的温度环境双歧杆菌虽然在温度范围内都可以生长但最适生长温度仍是温度必需根据每一种菌来选择适宜的温度在发酵罐中通过夹层或罐中的盘管通过冷热水进行调节控制的表是不同温度下发酵液的表不同温度对猪源双歧杆菌发酵特性的影响序号温度绘出生长曲线图北京理工大学珠海学院届本科生毕业论文图不同温度对猪源双歧杆菌发酵特性的影响起始培养基中的起始值直接影响菌的生长速度在生产中一般都把起始调整为最适值双歧杆菌最适值为然而在培养过程中随着菌体分解代谢培养基中的糖产生有机酸使下降双歧杆菌生长受到抑制生长减慢当下降到一定值时菌数不再增加表是不同起始值下发酵液的表不同初始值对猪源双歧杆菌发酵特性的影响序号绘制出生长曲线图北京理工大学珠海学院届本科生毕业论文图不同初始值对猪源双歧杆菌发酵特性的影响培养基的选定与所有的微生物一样双歧杆菌的基本营养需求也是六大营养素碳源氮源能源生长因子和水因为双歧杆菌是化能异养微生物故其碳源兼作能源现对双歧杆菌较独特的碳源氮源和生长因子的需求进行介绍碳源双歧杆菌细胞的含碳量约占干重的故碳源是活细胞除水分外需要量最大的营养物双歧杆菌的碳源谱比较窄最常用的碳源是单糖中的己糖部分菌种能利用戊糖只有极少数菌种还可利用淀粉双歧杆菌的主要碳源如下葡萄糖蔗糖麦芽糖蜜二糖果糖棉籽糖半乳糖核糖乳糖阿拉伯糖淀粉木糖氮源双歧杆菌由于其对蛋白质分解能力和氨基酸结合能力很弱因此在培养双歧杆菌时普遍需向他们提供含各种氨基酸和肽类的有机氮源包括蛋白胨酵母膏牛肉膏或番茄汁等生长因子双歧杆菌是一类对生长因子尤其是维生素依赖性很强的微生物至今未发现像大肠希氏菌那样能在只含有葡萄糖一种有机物的无机盐培养基上良好生长的北京理工大学珠海学院届本科生毕业论文双歧杆菌本研究中采用牛肝浸出液作为生长因子牛肝浸出液含有丰富的维生素碱基卟啉及其衍生物甾醇胺类和各种脂肪酸矿物质满足双歧杆菌的生长需要采用正交实验方法确定双歧杆菌最佳培养基配方四个因素是氮源为酵母浸膏胰蛋白胨和大豆蛋白胨为碳源采用葡萄糖为双歧因子低聚果糖为生长因子牛肝浸液表为不同培养基下发酵液的表猪源双歧杆菌培养基优化的正交实验结果序号因素指标值测定双歧杆菌的生长曲线基于以上三组已确定的条件测定双气杆菌的生长状况和产酸情况测定方法使用已确定的最佳培养方案培养双歧杆菌每小时从摇瓶中用灭菌针筒抽出培养液用精密计测定发酵液值发酵液稀释倍使用分光光度计在处测定吸光度做个平行试验表是根据以上方法测定的值和值北京理工大学珠海学院届本科生毕业论文表双歧杆菌的生长情况及变化根据测定的值和值描绘出双歧杆菌的生长曲线如图序号发酵时间北京理工大学珠海学院届本科生毕业论文图双歧杆菌生长曲线及变化曲线由由图可见发酵时间到生长曲线达到最大值菌体活性高生命力旺盛且经济效益高因此确定发酵生产周期为本章小结通过进行镜检观察菌体形态多种生理生化特性实验鉴定并绘制生长曲线等研究得出双歧杆菌最适初始值为最适培养温度为采用正交实验方法确定双歧杆菌最佳培养基配方为酵母膏胰蛋白胨大豆蛋白胨葡萄糖双歧因子低聚果糖生长因子牛肝浸液发酵周期为小时北京理工大学珠海学院届本科生毕业论文双歧杆菌发酵工艺条件的优化研究双歧杆菌制剂的生产工艺流程双杆菌生产工艺流程如下发酵方案的确定双歧杆菌制剂的生产一般是液体发酵但对乳酸细菌制剂生产所不同的是双歧杆菌对氧的要求比较高而且对厌氧的条件有比较严格的要求这就对生产的要求比较复杂尽管生产菌种经过耐氧驯化对氧有一定的耐受性但并不等于可以不需要厌氧环境因此在生产中创造良好的厌氧环境是首要任务在大规模生产中通常是在发酵罐中通入氮气或氮氢和二氧化碳混合气体厌氧发酵培养基组成及发酵条件的确定厌氧发酵的培养基组成酵母膏胰蛋白胨大豆蛋白胨葡萄糖双歧因子低聚果糖生长因子牛肝浸液发酵控制条件培养基灭菌后种子分别于摇瓶培养后转入发酵罐接种总量各发酵温度发酵时间发酵过程缓慢通入混合气体氮气二氧化碳氢气维持罐压以上发酵液活菌数的检测双歧杆菌活菌数的测定按测定操作步骤以无菌操作讲充分混匀的检样放入含有灭菌生理盐水的灭菌锥形瓶内作成的均匀稀释液用灭菌吸管吸取稀释液沿管壁徐徐注入含有灭菌生理盐水的试管内振摇均匀做成的稀释液另取灭菌吸管按上述操作顺序作倍递增稀释液如此每递增一次即北京理工大学珠海学院届本科生毕业论文换用支灭菌吸管选择个以上适宜稀释浓度分别在作倍递增稀释的同时各取分别加入技术培养基平皿均匀涂布每个稀释度作两个平皿同时选用和培养基见附录作检测用同时作灭菌生理盐水空杯对照待琼脂平面干后翻转平皿放置厌氧罐内操作全过程须在内完成将厌氧罐置温箱内培养观察双歧杆菌菌落特征见表选取菌落在之间的平板对可疑菌落进行计数随机选取五个可疑菌落进行革兰氏染色显微镜检查和过氧化氢酶试验过氧化氢酶阴性革兰氏染色阳性无芽孢着色不均匀出现或型的分叉状或棒状等多形态的杆菌可定为双歧杆菌表双歧杆菌在不同培养基上菌落生长形态特征培养基双歧杆菌特征培养基为黄色菌落中等大小表面光滑凸起边缘整齐呈奶油色质地柔软细腻培养基为黄色菌落表面光滑凸起边缘整齐呈奶油色瓷白色质地柔软细腻菌落计数根据证实为双歧杆菌的菌落数计算出平皿内的双歧杆菌数然后乘以样品的稀释倍数得每毫升样品中双歧杆菌数取两种培养基中计数较高的为最终结果例如检样倍的稀释液在琼脂平板上生成的可疑菌落为个取个鉴定证实为双歧杆菌的是个则样品中双歧杆菌数为发酵罐扩大培养试验升发酵罐的发酵试验结果见表北京理工大学珠海学院届本科生毕业论文表三批次升罐发酵液的活菌数活菌数批次双歧杆菌平均经过两次对发酵系统进行微调后发酵效果良好双歧杆菌产物的数量和质量达到预期效果发酵液的双歧杆菌活菌数均达到每mL在10亿个以上将发酵进一步扩大到升发酵罐进行生产研究试验发酵罐扩大培养试验升发酵罐的发酵研究结果见表表三批次100升罐发酵的活菌数活菌数批次双歧杆菌201004162010042020100425平均三次厌氧发酵试验中双歧杆菌活菌数均达到每mL在10亿个以上厌氧条件良好双歧杆菌活性高且无杂菌污染产量达到基本生产要求厌氧发酵方案可用于实际生产57本章小结通过双歧杆菌生理特性试验得到的发酵培养方案可用于实际生产此外10L扩大培养试验的平均产量比100L扩大培养产量少初步估计是由于10L发酵罐设备老化使厌氧环境相对不良而导致的若条件允许可用新的10L发酵罐再进行一次扩大发酵试验验证发酵方案的可行性北京理工大学珠海学院届本科生毕业论文结论与展望结论本文研究了从仔猪粪便中提取并鉴定出双歧杆菌并尝试用于生产的相关内容详细研究了将猪源双歧杆菌用于扩大发酵生产的最佳培养方案和合适的生产发酵周期所得结论如下烛缸法和焦性没食子酸法结合的厌氧培养方法培养双歧杆菌厌氧效果良好培养成功率达到以上成功分离双歧杆菌驯化出的菌种具有一定的氧耐受性通过一系列试验成功确定了双歧杆菌发酵培养的最佳方案成功描绘出双歧杆菌在最佳发酵方案下的生长曲线并大致测定了在该方案下的产酸情况通过试验把发酵生产规模逐步扩大到升发酵罐并且发酵结果符合生产要求展望双歧杆菌具有很重要的保健功效和医用价值本研究工作尚属初步今后可在下述方面进行更为深入和广泛的研究尝试使用天然培养基如胡萝卜汁番茄汁牛乳等培养基代替合成培养基发酵生产双歧杆菌进一步以人源双歧杆菌为研究材料研究其发酵生产方案并与猪源双歧杆菌的保健和医用功效作对比进一步研究双歧杆菌产品的包装和保鲜技术以保证双歧杆菌产品的菌活性双歧杆菌属放线菌门由于其形态特征对剪应力有一定的敏感度可以从此处入手进一步研究发酵罐内螺旋桨搅拌功率对双歧杆菌生长的影响北京理工大学珠海学院届本科生毕业论文参考文献李永敬金苏益生菌与健康生活中国轻工出版社张刚乳酸细菌基础技术和应用化学工业出版社陈历俊乳品科学与技术中国轻工业出版社郭兴华益生乳酸细菌分子生物学及生物技术科学出版社王顺余双歧杆菌的研究现状长春大学学报年期第页张明江等双歧杆菌用于肿瘤基因治疗的研究现状中国微生态学杂志年期第页员克勤张帅清焦性没食子酸培养厌氧菌的体会实用预防医学年期杨宝兰冉陆等食品卫生微生物学检验双歧杆菌检验中华人民共和国国家标准北京理工大学珠海学院届本科生毕业论文附录培养基的配制培养基成分胰胨大豆蛋白胨酵母粉葡萄糖吐琼脂半胱氨酸盐酸盐盐溶液蒸馏水制法将以上成分加热完全溶解校正至分装于锥形瓶中高压灭菌琼脂培养基成分水解酪蛋白植物胨酵母粉葡萄糖半胱氨酸磷酸氢二钾氯化镁硫酸锌氯化钙氯化铁微量吐温琼脂蒸馏水制法将以上成分加热完全溶解校正至分装锥形瓶高压灭菌琼脂培养基成分蛋白胨酵母粉葡萄糖可溶性淀粉氯化钠半胱氨酸西红柿浸出液吐温肝提取液琼脂蒸馏水制法西红柿浸出液的制备将新鲜西红柿洗净称重后切碎加等量蒸馏水在水浴中加热时时搅拌约然后用绒布过滤校正分装锥形瓶高压灭菌肝提取液的制备称取新鲜猪肝切成小块加蒸馏水至混匀置冰箱中过夜第二天煮沸绒布过滤并挤压收集全部滤液加水补足原量分装锥形瓶按上述成分配制校正分装锥形瓶高压灭菌北京理工大学珠海学院届本科生毕业论文附录双歧杆菌的糖代谢途径双歧杆菌体内存在的糖代谢途径是异型乳酸发酵的双歧杆菌途径又称途径这是一条仅存在于双歧杆菌中特殊异性乳酸发酵途径其特点是分子葡萄糖可产生分子乙酸分子乳酸和分子同时在途径中存在着两种磷酸转酮酶其一为磷酸果糖磷酸转酮酶催化磷酸果糖生成磷酸丁糖磷酸赤藓糖和乙酰磷酸另一为磷酸木糖磷酸转酮酶催化磷酸木糖生成磷酸甘油醛和乙酰磷酸如附图北京理工大学珠海学院届本科生毕业论文附图异型乳酸发酵的双歧杆菌途径北京理工大学珠海学院届本科生毕业论文谢辞历经几个月的毕业论文结束了大学四年的学习也即将随之落幕回想四年来在北京理工大学珠海学院的学习和生活要衷心感谢这个学校为我们提供良好的学习和生活环境感谢四年来教授我知识的老师们感谢给予我帮助的同学们因为这些我在北京理工大学珠海学院积累了丰富的知识培养了严谨的逻辑思考能力为我今天的论文奠定了扎实的基础在这里我要特别感谢我的指导老师周新明老师在他的悉心指导下我的论文得到不断完善他严谨求真务实的求学态度给我留下了深刻的印象是我今后工作学习的榜样同时他渊博的学识和丰富的人生经验让我学到了很多我在书本上学不到的知识另外要感谢广州市微生物研究所梁淑娃高级工程师以及陈勉华师姐赵培静师姐因为梁淑娃工程师的关爱让我有幸参与这次重要的研究在研究的过程中我在陈勉华师姐和赵培静师姐两位前辈的身上学到了对求真的执着和对工作的热情本文在编写过程终参考了大量宝贵的文献资料在此谨向文献资料的作者表示诚挚的敬意和衷心的感谢同时论文的顺利完成离不开其它各位老师同学和朋友的关心和帮助在整个的论文写作中各位老师前辈同学和朋友积极的帮助我查找资料和提供有利于论文写作的建议和意见在他们的帮助下论文得以不断的完善最终帮助我完整的写完了整个论文感谢这些老师前辈同学和朋友们另外要感谢在大学期间所有传授我知识的老师是您们的悉心的教导使我有了良好的专业课知识这也是论文得以完成的基础感谢我的大学和所有帮助过我并给我鼓励的老师同学和朋友