发酵工艺重点

第一章绪论发酵的定义通过微生物的生长和代谢活动产生和积累人们所需代谢产物的一切微生物培养过程发酵工程是指利用微生物的生长繁殖和代谢活动来大量生产人们所需产品过程的理论和工程技术体系微生物发酵产品分为按发酵类型微生物菌体细胞酶制剂和酶调节剂微生物代谢产物包括初级代谢产物和次级代谢产物以及微生物转化工程菌发酵产物等发酵培养方法表面培养发酵法和深层培养发酵法液体深层培养法的基本工艺过程菌种选育孢子制备种子制备发酵培养发酵液预处理提取精制成品检验成品包装第二章菌种选育工业发酵三个技术领域菌种选育发酵工艺上游工程和分离提取工艺下游工程菌种选育在发酵生产上的目的提高发酵产量改进菌种性能产生新的发酵产物去除多余的组分微生物突变的修复光修复切补修复重组修复修复系统聚合酶的校正作用菌种选育的方法自然选育诱变育种杂交育种基因工程育种原生质体育种自然选育是指利用微生物在一定条件下产生自发突变的原理通过分离筛选排除衰退型菌株从中选出维持或高于原有生产菌株的过程以达到稳定或提高生产的目的菌种退化菌种在长期的传代保存过程中由于自发突变使菌种变得不纯生产能力下降原因有菌种遗传特性的改变经诱变剂处理后的退化变异菌种生理状况的改变培养条件自然选育的一般过程单孢子悬浮液的制备分离出单菌落单菌落传斜面摇瓶初筛菌种保藏摇瓶复筛放大试验诱变育种是利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群体促进其突变率大幅提高然后采用简便高效的筛选方法从中选出少数具有优良性状的突变菌株主要包括出发菌株的选择诱变处理和筛选突变株三个部分诱变育种的步骤出发菌株的选择悬浮液的制备诱变处理中间培养突变株的分离和筛选自发突变微生物未经人为诱变剂处理或杂交等生物技术手段而自然发生的突变诱发突变人为用化学物理诱变剂处理微生物而引起的突变表型延迟微生物表型的改变总是落后于基因型改变的现象理性化筛选定向筛选运用遗传学生物化学的原理根据产物已知的或可能的生物合成途径代谢调控机制和产物分子结构来进行设计和采用一些筛选方法以打破微生物原有的代谢调控机制获得能大量形成产物的高产突变株初级代谢产物高产菌株的筛选筛选细胞膜透性改变的突变株筛选营养缺陷型突变株筛选结构类似物抗性突变株次级代谢产物主要是抗生素高产菌株的筛选筛选营养缺陷型突变株筛选负变株或零变株的回复突变株筛选去磷酸盐调节突变株筛选去碳源分解代谢调节突变株筛选氨基酸结构类似物抗性突变株筛选二价金属离子抗性突变株筛选前体或前体结构类似物抗性突变株筛选自身所产的抗生素抗性突变株影响原生质体制备的因素培养基组成菌龄酶浓度酶解温度和酶解时间渗透压稳定剂影响原生质体再生的因素再生培养基组成培养基中水分菌体生理状态稳定剂酶作用浓度及时间原生质体融合的一般过程遗传标记的选择再生亲本原生质体的制备原生质体的融合原生质体的再生融合子的选择第三章培养基培养基人工配制的供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物的多种营养物质的混合物培养基成分包括碳源能源氮源磷源硫源无机盐水生长因子前提促进剂抑制剂等速效碳源氮源和迟效碳源氮源生理酸性碱性物质经过微生物代谢作用后形成酸性碱性物质的营养成分前体微生物代谢产物的合成过程中能直接被微生物利用构成产物分子结构的一部分而化合物本身的结构没有大变化的物质诱导物一般指一些特殊的小分子物质在微生物发酵过程中添加这些小分子物质后能够诱导代谢产物的生物合成提高发酵产量促进剂是指那些细胞生长非必需的但加入后却能显著提高发酵产量的一些物质常以添加剂的形式加入发酵培养基中抑制剂发酵过程中加入某些化学物质会抑制某些代谢途径的进行同时会使另一代谢途径活跃从而获得所需代谢产物或使正常代谢产物的中间产物积累的物质发酵生产培养基孢子培养基斜面培养基种子培养基发酵培养基和补料培养基影响培养基质量的因素原材料质量水质灭菌培养基粘度培养基的筛选方法单因子试验法正交试验均匀设计第四章灭菌与除菌染菌的危害消耗基质或产物造成生产能力的下降反应异常值提取更加困难生产菌细胞将被裂解使生产失败湿热灭菌法利用饱和蒸汽灭菌使微生物体内的蛋白质发生凝固作用而致死特点是蒸汽有很强的穿透力冷凝时放出大量的潜热来源方便价格低廉灭菌效果好是目前最基本的适合培养基和设备的灭菌方法一般条件为热阻微生物在某一特定条件主要指温度和加热方式下的致死时间相对热阻某种微生物在某一条件下的致死时间与另一种微生物在相同条件下的比值对数残留定律和对数穿透定律和分批灭菌将配制好的培养基输入发酵罐内用直接蒸汽加热达到灭菌要求的温度和压力后维持一定时间再冷却至发酵要求的温度这一工艺过程称分批灭菌实罐灭菌优点设备要求低操作简便缺点营养成份有损失罐利用率低不能采用高温快速灭菌工艺连续灭菌将配置好的培养基在向发酵罐等培养装置输送的同时进行加热保温和冷却而进行灭菌优点可采用高温短时灭菌培养基受热时间短营养成分破坏少有利于提高发酵产率发酵罐利用率高可采用高温短时灭菌缺点不适合容积小的发酵罐空气除菌的方法辐射杀菌热杀菌静电除菌过滤除菌深层过滤原理微粒气流运动方向改变引起微粒对滤层纤维产生惯性冲击滞留阻截滞留重力沉降布朗扩散静电吸附等作用而把微粒滞留在纤维表面上空气过滤除菌设备前过滤器空气压缩机冷却器分水器储气罐加热器总过滤器等无菌检查的方法肉汤培养法显微镜检查法镜检法平板划线培养或斜面培养检查法染菌来源空气系统设备培养基种子工艺操作等第五章菌种制备与保藏发酵生产中种子必须满足的条件生长活力强生理形状稳定菌体数量足够无杂菌污染生产力稳定生产菌种的制备一般包括两个过程孢子制备和种子制备菌种进入种子罐的两种方法孢子进罐法生长快和摇瓶菌丝进罐法生长慢种子制备将固体培养基上培养出的孢子或菌体转入到液体培养基中培养使其繁殖成大量菌丝或菌体的过程级种子级发酵种子罐的级数取决于菌种性质菌体生长速度发酵设备的合理利用影响孢子质量的因素培养基培养温度和湿度培养时间和接种量影响种子质量的因素培养基培养条件种龄和接种量菌种保藏目的保持优良菌种生产性能的稳定不污染杂菌不死亡原理根据菌种的生理生化特性人工创造条件使菌体的代谢活动处于休眠状态菌种保藏方法斜面低温保藏法液体石蜡封存保藏法固体曲保藏法沙土管保藏法冷冻干燥法液氮超低温保藏法引起菌种退化的原因主要有基因突变变异菌株性状分离连续传代其它因素温度湿度培养基培养条件第六章发酵过程中的供养摄氧率单位体积培养液每小时消耗氧的量呼吸强度单位重量干菌体在单位时间内所吸取的氧量呼吸临界氧浓度在溶氧浓度低时呼吸强度随溶解氧浓度的增加而增加当溶氧浓度达某一值后呼吸强度不再随溶氧浓度的变化而变化此时的溶氧浓度称为临界氧浓度影响微生物需氧量的因素微生物种类和生长阶段培养基的组成培养液中溶解氧浓度培养条件的影响氧传递的阻力供养阻力和需氧阻力氧的传递速率影响供氧的主要因素有和氧传递推动力气泛点在特定条件下通入发酵罐内的空气流速达某一值时使搅拌功率下降当空气流速再增加时搅拌功率不再下降此时的空气流速称为气泛点发酵液中溶解氧浓度的测定亚硫酸钠测定法普遍采用复膜氧电极测定法第七章发酵过程的控制发酵类型按操作方式分批发酵补料分批发酵和连续发酵按与氧关系需氧发酵和厌氧发酵按发酵动力学参数的关系生长偶联型部分生长偶联型和非生长偶联型初级代谢细胞在生命活动过程中进行的与菌体生长繁殖相关的一类代谢活动其产物即为初级代谢产物特点生长分为几个阶段延迟期对数期稳定期死亡期营养物质的消耗与菌体生长密切相关代谢产物的合成与菌体生长紧密相关次级代谢菌体生长阶段产物合成阶段菌体自溶阶段个阶段菌体浓度单位体积培养液中菌体的含量影响因素微生物种类和遗传特性营养物质的种类与浓度菌体生长环境条件临界菌体浓度为获得最高生产率需采用摄氧速率与传氧速率相平衡时的菌体浓度称是菌体的遗传特性和发酵罐的传氧特性共同影响的结果最适菌体浓度在一定发酵条件下使微生物的呼吸不受抑制时的最大菌体浓度碳源的浓度控制方法经验方法中间补料动力学方法根据菌体比生长速率产物比合成速率糖比消耗速率来控制发酵培养基一般选用快速利用和缓慢利用的氮源组成的混合氮源抗生素发酵通常采用生长亚适量的磷酸盐浓度温度对发酵的影响影响酶的活性影响发酵液的物理性质影响代谢产物的合成方向发酵热就是发酵过程中释放出来的净热量是各种产生的热量减去各种散失的热量所得的净热量生物热微生物在生长繁殖过程中产生的热量影响因素有菌种培养基培养时间和菌体呼吸强度最适发酵温度的选择根据不同发酵阶段和发酵条件选择最适温度对发酵的影响影响酶活影响基质或中间产物的接力状态影响发酵产物的稳定性影响发酵变化的因素菌种遗传特异性培养及成分发酵工艺条件发酵过程的确定根据发酵阶段控制一般和发酵实验结果控制的方法调节培养基的组成补料加入缓冲剂加入酸或碱改变发酵条件引起溶氧异常下降的原因污染好气性杂菌菌体代谢发生异常现象需氧要求增加设备或工艺控制发生故障或变化引起溶氧异常升高的原因菌体代谢出现异常耗氧能力下降污染烈性噬菌体影响最为明显产生菌未裂解前呼吸已受抑制直到菌体破裂完全失去呼吸能力溶氧直线上升溶氧控制的一般策略前期大于临界溶氧浓度中后期满足产物的形成发酵初期采用小通风停搅拌影响对微生物生长和发酵具有刺激或抑制作用通气搅拌是控制浓度的一种方法补料分批培养又称半连续培养或半连续发酵指在分批培养过程中间歇或连续地补加一种或多种成分的新鲜培养基的培养方法是分批培养和连续培养之间的一种过渡培养方式补料分批培养的优点与分批培养比可以解除培养过程中的底物抑制产物反馈抑制葡萄糖分解阻遏效应可以避免在分批培养过程中因一次性投糖过多造成的细胞大量生长耗氧过多以致通风搅拌设备不能匹配的状况可为发酵过程的自动控制和最优化控制提供必需的方法的作用控制抑制性底物浓度解除或减弱分解产物阻遏使发酵过程最佳化补料原则控制微生物的中间代谢使之向着有利于产物积累的方向发展泡沫形成的原因通气搅拌的强烈程度培养基原料组成菌种灭菌质量发酵液物理性质泡沫的不利影响装料系数减少氧传递系数减少染菌几率增加菌体呼吸受阻泡沫的控制调整培养基中的成分及改变发酵工艺消除泡沫机械消沫和消沫剂消沫第八章次级代谢产物的合成初级代谢产物与微生物的生长密切相关的代谢产物包括氨基酸蛋白质核酸维生素等主要特点有微生物生长所必需各种微生物所共有次级代谢产物与微生物生长繁殖无关的代谢产物包括色素抗生素生物碱毒素等主要特点菌属特异性特定生长阶段产物及多组分混合物分叉中间体微生物代谢过程中既可以被微生物用于合成初级代谢产物又可以用于合成次级代谢产物的中间代谢物如氨基己二酸初级代谢产物与次级代谢产物关系初级代谢产物是次级代谢产物的前体并影响次级代谢产物的合成合成次级代谢产物的构建单位氨基酸及其衍生物糖及氨基糖聚酮体及其衍生物核苷酸衍生物等次级代谢产物的合成过程构建单位的合成构建单位的连接产物合成后的修饰第九章次级代谢产物合成的调控在发酵工业中调节微生物生命活动的方法很多包括生理水平代谢途径水平和基因调控水平上的各种调节次级代谢产物生物合成的主要调控机制有诱导调节反馈调节碳分解产物调节氮分解产物调节磷酸盐调节生长速率调节及化学调节因子调节微生物的代谢调节酶代谢调节酶活性的调节基因调节酶合成的调节反馈调节反馈阻遏与反馈抑制调控水平分别是水平表达阻遏蛋白产生效应慢和酶分子变构变构效应产生效应快酶活力调节是指一定数量的酶通过其分子构象或分子结构的改变来调节其催化反应的速率一般是通过激活或抑制已有酶的活力来实现其特点是反应快速酶的激活剂主要是金属离子代谢激活作用前体激活代谢中间产物激活酶活性的抑制主要是反馈抑制酶合成调节是通过酶量的变化来控制代谢速率水平上起作用包括合成诱导乳糖操纵子和合成阻遏色氨酸操作子酶合成的诱导作用可表现出协同诱导和顺序诱导两种情况对诱导调节控制的常用手段有添加诱导物类似物添加辅酶或辅助因子利用组成型突变株克服反馈调节可从以下两方面着手降低末端产物浓度应用抗反馈突变株营养缺陷型是指原菌株因基因突变致使合成途径中断丧失了合成某种必须物质的能力而必须在培养基中加入相应物质才能正常生长的突变菌株渗透缺陷性是一种特殊的营养缺陷型酶活下降不消失工业上用谷氨酸棒杆菌的腺苷酸缺陷型生产肌苷酸一般情况下凡是能被微生物快速利用促进产生菌快速生长的碳源氮源对次级代谢产物生物合成都表现出抑制作用如可快速利用的葡萄糖致使青霉素产量特别低而缓慢利用的乳糖却能较好地生产青霉素葡萄糖效应葡萄糖有利于菌体的生长繁殖但抑制青霉素的合成而乳糖有利于青霉素的合成的现象氮分解产物调节机制阻遏次级代谢产物生物合成酶的合成调节初级代谢继而影响次级代谢产物的合成生产中要克服分解代谢阻遏可采取下列措施避免使用有阻遏作用的碳源和氮源流加碳源或氮源利用抗分解代谢阻遏的突变体磷酸盐的调节机制促进初级代谢抑制次级代谢抑制次级代谢产物前体的形成阻遏次级代谢产物合成中某些关键酶的合成的调节作用磷酸盐调控的分子机制因子异辛酰基羟甲基丁内酯链霉素产生菌灰色链霉菌可以产生一中小分子物质对链霉素的合成起着开关的作用影响次级代谢产物产量的因素及改进措施调节效应改进措施及方法碳分解代谢物的阻遏慢代谢碳源或慢补料氮分解代谢物的阻遏慢代谢氮源或慢补料或加入磷酸镁形成氨复合物磷酸阻遏耐砷突变株对生产产品的毒性抗性突变株分泌不好加表面活性剂或寻找脂肪酸合成障碍突变株产物自身反馈调节寻找结构类似物抗性突变株或抗反馈突变株