制药工程专业毕业论文.docx

I中国医科大学毕业设计论文猪心中细胞色素C的提取工艺研究学院XX学院专业制药工程班级20XX级X班学生姓名学生姓名学号12345678指导教师X教授202X年3月II猪心中细胞色素C的提取工艺研究摘要目的细胞色素C是一种细胞呼吸激活剂细胞色素C与细胞凋亡有密切关系它广泛存在于各种动物植物组织和微生物中以猪心为原料来提取纯化细胞色素C并将细胞色素C进行纯化方法取猪心在酸性条件下提取细胞色素C粗品后通过吸附法将细胞色素C进行提纯并对比不同条件下的提取率结论测定其含量为285关键词细胞色素C提取提纯ThepigheartinextractionandpurificationofcytochromeCAbstractObjectiveCytochromeCisakindofcellrespirationactivatorcytochromeChascloserelationshipwithcellapoptosisitwidelyexistsinvariouskindsofanimalplantandmicrobewithpigheartasrawmaterialtoextractpurifiedcytochromeCandcytochromeCandpurificationMethodsThepigsheartwasextractedunderacidicconditionsandthecellpigmentCwaspurifiedbyadsorptionmethodandtheextractionratewascomparedunderdifferentconditionsResultsDeterminationofitscontentis285KeywordsCytochromeCextractpurification11前言细胞色素C溶液用于各种组织缺氧急救的辅助治疗1目前很多高发的疾病和难以治愈的慢性疾病都和细胞色素C有关细胞色素C对细胞的凋亡细胞组织的生长对细胞器官的发育都有着很大的影响细胞色素C广泛存在于人体细胞中所以细胞色素C对人体机能的平衡影响也非常大因此细胞色素C的研究对生物学有着重大的意义可以说细胞色素C的价值很高应用前景非常的广泛细胞色素C在不仅临床急救的应用很广而且细胞色素C对很多慢性病的治疗也十分有效想要得到细胞色素C也十分简单我们可以从动物体内提取细胞色素C动物心脏中含有丰富的细胞色素C本实验正是从猪心中提取细胞色素C细胞色素是呼吸链中重要的电子传递体细胞色素包含很多种细胞色素C只是细胞色素的一种细胞色素C主要存在于线粒体中需氧最多的组织及酵母细胞和心肌细胞中细胞色素C的含量非常的丰富目前来看心血管疾病脑组织损伤癌症败血症糖尿病和神经性的疾病在全球的发病率非常高在这些疾病中细胞色素C均表现出不同程度的代谢紊乱细胞色素C是由两个无活性的前体分子合成的即前细胞色素C和亚铁血红素2硫酸铵盐析可明显提高细胞色素C纯度主要为去除杂蛋白另外三氯乙酸可引起细胞色素C变性和聚合必须严格控制三氯乙酸用量细胞色素CCytochromeC是从猪心中提取的细胞呼吸激活剂是含铁卟啉的色蛋白质3在心肌与其他做剧烈运动的肌肉中含量最为丰富细胞色素C主要作为电子载体或者氧化还原酶参与细胞的能量传递过程4硫酸铵盐析可明显提高细胞色素C纯度主要为去除杂蛋白另外三氯乙酸可引起细胞色素C变性和聚合必须严格控制三氯乙酸用量5细胞色素C是细胞凋亡的重要信息物质之一发展简单快速的细胞色素C的检测方法对于临床检测和生物学研究具有重要意义67它在多细胞生物的组织分化器官发育机体稳态的维持中有着非常重要的意义810外源性细胞色素C是不能进入健康细胞1112从线粒体中泄露出的细胞色素C有诱导细胞凋亡的作用1315在生物氧化过程传递电子中细胞色素C起到了重要的作用1618细胞色素C的研究对现代生物药物的研究有着很重要的意义生物制药是近几十年来研究的热门而且细胞色素C在临床上应用十分广泛在抢救患者生命2中也扮演者非常重要的角色细胞色素C能用于各种组织细胞缺氧的治疗比如一氧化碳中毒的患者还有心肌缺氧的患者都可以通过注射细胞色素C来得到及时的抢救同时细胞色素C的提取工艺也非常的简单利用其易溶于酸的特性通过简单的吸附法能简单有效的得到细胞色素C提取物原料的来源也非常多动物的心脏含有非常丰富的细胞色素C所以细胞色素C的药物制品是一种非常廉价又使用效果很好的药物非常值得研究和发展通过本实验的研究希望能更好的利用细胞色素C来防治疾病2材料与方法21实验材料与仪器211实验材料猪心市场购买的新鲜猪心2molLH2SO4溶液1molLNH4OH氨水溶液02NaCl溶液25NH42SO4溶液100ml溶液中含25gNH42SO4约为25摄氏度时40的饱和度BaCl2试剂称BaCl212g溶于100ml蒸馏水中20三氯乙酸TCA溶液人造沸石Na2OAl2O3xSiO2yH2O白色颗粒不溶于水溶于酸选用6080目联二硫酸钠212实验仪器绞肉机电磁搅拌器电动搅拌器离心机722型分光光度计玻璃柱25cm30cm一根烧杯不同容量若干500ml下口瓶量筒移液管玻棒抽滤机透析纸滤纸纱布玻璃漏斗22实验方法221细胞色素C的提取取新鲜的猪心一颗去除血块肌腱和脂肪切成条块状洗掉血液用绞肉机将其绞碎称取心肌碎肉加入1到2倍量的蒸馏水搅拌均匀用1molL的硫酸调整PH到4左右在常温条件下搅拌提取两个小时然后进行压滤滤液用1molL的氨水调节PH至62离心得到提取液滤渣再加等量蒸馏水同上方法重复提取一次合并两次提取液提取液加入2molL氨水调节PH至75再在冰浴中静置沉淀杂蛋白吸取上层清液每升提取液加入10g人造沸石搅拌吸附40分钟静置去掉上层清液收集吸附细胞色素C的人造沸石再用蒸馏水洗涤三次2gL的氯化钠洗涤4次再用蒸馏水洗至洗液澄清为止过滤抽干装入柱内用253硫酸铵溶液进行洗脱得到洗脱液222细胞色素C的纯化将洗脱液加入固体硫酸铵达到45的饱和度相对密度121到123使杂志蛋白析出然后过滤收集透明液体然后慢慢加入20的三氯乙酸25mlL按体积计算边加边搅拌使细胞色素C沉淀析出离心收集沉淀将沉淀溶于蒸馏水装入透析袋中用常水和蒸馏水透析至无硫酸根为止最后过滤得到细胞色素C粗品溶液粗品溶液通过处理好的AmberliteIRC50NH4树脂柱吸附然后将树脂移入大烧杯中用水洗到澄清为止再分别上柱用06molL磷酸氢二钠04molL氯化钠混合溶液洗脱流速2mlmin洗脱液用蒸馏水透析去离子得到细胞色素C精致液23细胞色素C的含量测定本实验得到的细胞色素C是氧化型和还原型的混合物因此在测定含量时要加入联二亚硫酸钠使混合物中的氧化型细胞色素C转变为还原型还原型的细胞色素C水溶液在波长520mm处有最大吸收值根据这一特性用国产722型分光光度计选一标准品做出细胞色素C浓度和对应的光吸吸收值的标准曲线然后根据所测溶液的光吸收值由标准曲线的斜率求出所测样品的含量3结果与分析31细胞色素C提取纯化试验结果311细胞色素C提取时料液比对结果的影响分别称取50g取绞碎后的猪心肌肉糜用蒸馏水浸提分别加入蒸馏水为50mL100mL150mL200mL在pH为40条件下30浸提2小时提取液采用人造沸石吸附NH42SO4洗脱三氯乙酸沉淀法纯化得到细胞色素C粗品5mL蒸馏水溶解细胞色素C粗品后520nm处测吸光值考察料液比对提取效果的影响结果图1表明随着水量的增大吸光值越大料液比为12时为最佳提取条件4图1吸光度随蒸馏水量的变化312细胞色素C提取时PH对结果的影响100mL蒸馏水温度为30选择提取pH分别为30405060浸提2h提取液采用人造沸石吸附NH42SO4洗脱三氯乙酸沉淀法纯化得到细胞色素C粗品5mL蒸馏水溶解细胞色素C粗品后20nm处测吸光值考察pH对提取效果的影响图2表明PH为40时吸光值最大所以PH为40时为最佳的提取条件图2吸光度随PH的变化313细胞色素C提取时温度对结果的影响分别称取50g取绞碎后的猪心肌肉糜加入100mL蒸馏水分别在253035和40条件下pH为40浸提2h提取液采用人造沸石吸附NH42SO4洗脱三氯乙酸沉淀法纯化得到细胞色素C粗品5mL蒸馏水溶0005010150202503035040501001502002500250260270280290303103225335445555665PH5解细胞色素C粗品后520nm处测吸光值考察浸提温度对提取效果的影响图3表明温度在30时吸光值最大所以最佳的提取温度条件为30图3吸光度随温度的变化32细胞色素C得率的测定00050101502025030352025303540456取1ml标准品80mgml稀释至25ml从中分别取得0204060810ml分别放置在5个试管当中每管补加蒸馏水到4ml并加入少许联二亚硫酸钠作为还原剂然后在520mm处测得吸光值分别为01770328051706990867以浓度为横坐标吸光值为纵坐标作出标准曲线图4图4细胞色素C浓度吸光值标准曲线图反复实验结果得知520mm处测平均吸光值为0305据图4得知浓度测得得率为2854讨论本次实验主要利用了细胞色素C在酸性条件下溶解度大利用吸附法将细胞色素C吸附并提取纯化吸附法设备简单操作方便廉价安全吸附洗脱过程中PH变化小较少引起生物活性物质失活本实验以新鲜猪心为材料经过酸溶液提取人造沸石吸附硫酸铵溶液洗脱和三氯乙酸沉淀等步骤制备细胞色素C并测定其含量的操作简单方便并且比较了不同条件下提取纯化对提取结果的影响用最佳的方式提取并得到了细胞色素C纯化制品细胞色素C的研究对生物学有着非常重要的意义1920本次实验受到实验幻境的影响和多方面的因素因此本次试验存在一定的误差需要经过多次反复操作方可符合要点要求00102030405060708090020406081Cmgml7参考文献1肖云从猪心中提取纯化细胞色素C工艺研究N武汉武汉职业技术学院201522王艳杰邓雯张鹏飞细胞色素C与细胞凋亡研究进展J动物医学进展20122015183李六水细胞色素C对庆大霉素依替米星致大鼠肾小管毒性的预防作用研究D安徽安徽医科大学2012514付慧慧Shewanellaoneidensis呼吸替补通路及细胞色素c成熟机制的研究D浙江浙江大学2016415马志科秦川牛心肌细胞色素C和辅酶Q10提取纯化及检测的研究D西北农林科技大学20151116尹雪花新型纳米材料的制备及其在细胞色素C检测中的应用D湖南湖南大学2016517赵丹贺莉芳刘晖李晓飞刘流晏容线粒体细胞色素CCaspase与细胞凋亡J医学动物防治20120720268吉浩宇王小龙早期激素性股骨头坏死过程中细胞色素C的作用J中国组织工程研究20160535389韩蕊ShewanellaoneidensisMR1外膜细胞色素c介导的胞外电子传递过程研究D华南理工大学201662610覃芳细胞色素C氧化酶的表达纯化及其活性测定D湖南湖南大学20136111叶平宋金辉侯连生细胞色素C在盘基网柄菌细胞凋亡中的作用J动物学杂志201508505512刘萍丛国正独军政邵军军林彤常惠芸细胞凋亡信号传导通路的研究进展J湖北农业科学201303202313刘畅王筠姜丁文内质网应激在高糖诱导心肌细胞凋亡中的作用J广东医学201201364014马宇洁杨兴易林兆奋缪明永张雷宁波大鼠心肺复苏后神经细胞线粒体通透性转换孔变化在细胞色素C释放中的作用J中华急诊医学杂志2013810111315金苗Shewanellaoneidensis细胞色素C成熟系统及亚硝酸盐抑制其延胡索酸呼吸分子机制的研究D浙江浙江大学201616高小娥猪心中细胞色素C的提取与鉴定J南方农机201610232617王佺荃张文丽元小冬彭伟骆泓洁线粒体在细胞凋亡中的作用J中国医学创新201506303218沈泓林琼秋易喻梅建凤庄震远应国清应用疏水层析法纯化hcg单克隆抗体J药物生物技术201205293119张瑜细胞色素C在硼掺杂金刚石电极上的电化学特性研究J天津天津理工大学201420唐乾史珊珊曹洪玉郭相金张涛郑学仿细胞色素C与NO的反应机制J无机化学学报20150823279致谢不知不觉我在xx的四年学习时光过去了在这四年中特别感谢我所有的老师他们严谨敬业认真负责在本次论文实验中实验室的整个过程都在麻烦xx老师并得到了他无私的帮助在此特别的感谢他同时也非常感谢实验室里所有同学的帮助在整个论文中无论论文的选题资料的搜集实验的操作以及论文的撰写和修改最感谢的人是指导老师朱丹丹感谢她所有的细心指导和大力支持以及鼓励毕业在即感谢所有老师和同学的陪伴毕业在即在今后的工作和生活中我会铭记师长们的教诲继续不懈努力和追求来报答所有支持和帮助过我的人xx本科论文设计文献综述7文献综述细胞色素C的研究进展摘要目前心血管疾病脑组织损伤癌症败血症糖尿病和神经性的疾病在全球的发病率非常高在这些疾病中细胞色素C均表现出不同程度的代谢紊乱许多中药提取物有效部位和化学成分对这些疾病有良好的治疗作用和较小的副作用中药主要是通过影响疾病相关组织或细胞线粒体内的细胞色素C的产生或释放调控相应靶细胞的凋亡进而防治相应的疾病查阅近年来的相关文献报道综述了通过调控线粒体通路细胞色素C实现治疗疾病的中药提取物有效部位和化学成分希望能提高防病治病中作用机制的认识关键词细胞色素C药理作用疾病防治1前言细胞色素是包括多种能够传递电子的含铁蛋白质的总称它广泛存在于各种动植物和微生物中细胞色素的呼吸链中极其重要的电子传递体细胞色素C只是细胞色素的一种它主要存在于线粒体中需氧最多的组织如心肌及酵母细胞中细胞色素C的含量十分丰富1细胞色素C溶液用于各种组织缺氧急救的辅助治疗如新生儿窒息一氧化碳中毒氰化物中毒催眠药中毒严重休克期缺氧脑震荡后遗症脑血管意外麻醉及肺部疾病引起的呼吸困难和各种心脏疾患引起的心机缺氧的治疗25人类疾病的发生主要与细胞的凋亡和增值密切相关局部的细胞凋亡和增值失去平衡了之后就会引发各种疾病线粒体凋亡途径中细胞色素C起着非常重要的作用67细胞色素C的研究对生物学有着重大的意义细胞色素C易溶于酸性溶液故采用酸化水提取在pH75时细胞色素C呈正电荷它可与沸石分子上的钠离子发生交换从而被沸石吸附人造沸石为铝酸钠它是一种阳离子交换剂细胞色素C分子刚好进入它的表面空隙细胞色素C是由一条含有104个氨基酸残基的多肽链及具有氧化原活性的血红素组成的其生理功能的发挥也伴随着分子构象的变化810分子内各集团所处的微环境也随之改变天然的细胞色素C主要是螺旋血红素上的铁原子xx本科论文设计文献综述8与两个轴向配体配位1113细胞色素C是粒体内膜上的嵌入蛋白位于线粒体内膜外侧细胞色素C是由两个无活性的前体分子合成的即前细胞色素C和亚铁血红素2细胞色素C提取纯化的研究21细胞色素C性质通过文献可以得知细胞色素C为含铁的结合蛋白质分子量大约为13000蛋白质部分由104个左右的氨基酸残基构成的他溶于水在酸性溶液中溶解度更大所以可以从酸性溶液中提取制品可为还原型和氧化型两种氧化型水溶液呈红色还原型水溶液呈桃红色细胞色素C对热酸和碱都比较稳定但三氯乙酸和乙酸可使其变性引起部分失活211细胞色素C的提取细胞色素C易溶于酸溶液首先取猪心去血块脂肪和肌腱等然后切成块状洗去血液在绞肉机中绞碎称取心肌碎肉加入1到2倍量的蒸馏水搅拌均匀用1molL的硫酸调整PH到4左右在常温条件下搅拌提取两个小时然后进行压滤滤液用1molL的氨水调节PH至62离心得到提取液滤渣再加等量蒸馏水同上方法重复提取一次合并两次提取液提取液加入2molL氨水调节PH至75再在冰浴中静置沉淀杂蛋白吸取上层清液每升提取液加入10g人造沸石搅拌吸附40分钟静置去掉上层清液然后收集吸附细胞色素C的人造沸石然后再用蒸馏水洗涤三次2gL的氯化钠洗涤4次再用蒸馏水洗至洗液澄清为止过滤抽干装入柱内用25硫酸铵溶液进行洗脱得到洗脱液212细胞色素C的纯化洗脱液加入固体硫酸铵达到45的饱和度相对密度121到123使杂志蛋白析出然后过滤收集透明液体然后慢慢加入20的三氯乙酸25mlL按体积计算边加边搅拌使细胞色素C沉淀析出离心收集沉淀再将沉淀溶于蒸馏水装入透析袋中先用常水后用蒸馏水透析至无硫酸根为止过滤得到细胞色素C粗品溶液粗品溶液通过处理好的AmberliteIRC50NH4树脂柱吸附然后将树脂移入大烧杯中用水洗到澄清为止再分别上柱用06molL磷酸氢二钠04molL氯化钠混合溶液洗脱流速2mlmin洗脱液用蒸馏水透析去离子得到细胞色素C精致液xx本科论文设计文献综述93细胞色素C的药理作用研究31缺氧急求研究本品用于组织缺氧的急救和辅助用药比如一氧化碳中毒催眠药中毒新生儿窒息严重休克缺氧麻醉及肺部疾病引起的呼吸困难高山缺氧脑缺氧心脏疾病引起的缺氧等问题根据文献可以得知细胞凋亡是一种由基因调控的细胞主动死亡过程在机体生长发育细胞分化和病理状态中起着重要作用已成为近30年来研究热点线粒体在细胞凋亡过程中起着重要作用而细胞色素C从线粒体释放到胞浆细胞是凋亡程序关键的一步在凋亡机制中发挥着重大作用细胞色素C在急救患者缺氧窒息和一氧化碳中毒有着非常好的效果1432细胞色素C与细胞凋亡的研究线粒体细胞色素C释放在细胞凋亡过程中起重要作用细胞的凋亡是当前生物学领域中研究的最新课题之一细胞的凋亡在保证多细胞生物健康生存的过程中扮演着关键角色对个体的正常发育具有非常重要的作用它在多细胞生物的组织分化器官发育机体稳态的维持中有着非常重要的意义目前对与细胞凋亡的研究已进入分子水平在细胞凋亡的机制相关基因及其应用方面都取得了不小的进展细胞色素C是线粒体呼吸链的重要组成部分它是由两个无活性的前体分子合成的前细胞色素C该蛋白质由细胞核基因编码然后被转运至线粒体和亚铁血红素由线粒体合成由于细胞色素C具有亚铁血红素基团它可以在呼吸链复合酶细胞色素还原酶和IV细胞色素氧化酶之间传递电子细胞色素C缺乏时电子传递链被阻断将导致两方面的后果ATP合成减少及不完全氧化造成的超氧阴离子ROS过度生成而ROS是诱导凋亡的重要因素144结论跟据大量文献的报道许多研究表明细胞色素C在脑缺血损伤所致的凋亡中起到非常重要的作用1517线粒体在凋亡过程中起中心控制作用而线粒体因子如细胞色素C的释放则是支配细胞命运的关键因素1819对这一信号途径及其相关事件的认识对进一步了解凋亡的正常生理和病理过程它在肿瘤及神经退xx本科论文设计文献综述10行性疾病中的调控以及新型细胞毒药物和细胞保护药的发展具有重要意义研究细胞色素C对许多疾病的治疗有非常重要的意义20参考文献1王艳杰邓雯张鹏飞细胞色素C与细胞凋亡研究进展J动物医学进展2012315182肖云从猪心中提取纯化细胞色素C工艺研究D武汉武汉职业技术学院201523杨泽栋李永东细胞色素C评价心肌细胞凋亡的研究进展J医学综述20120333364李六水细胞色素C对庆大霉素依替米星致大鼠肾小管毒性的预防作用研究D安徽安徽医科大学2012515付慧慧Shewanellaoneidensis呼吸替补通路及细胞色素c成熟机制的研究D浙江浙江大学2016416陈剑钰林兵张宏秦路平中药调控细胞色素C的研究进展J现代药物与临床20140833367刘晓婷王延让张明线粒体介导细胞凋亡的研究进展J环境与健康杂志20130215198阎海细胞凋亡研究进展J中山大学研究生学刊自然科学医学版20120328319刘萍丛国正独军政邵军军林彤常惠芸细胞凋亡信号传导通路的研究进展J湖北农业科学201003192410高小娥猪心中细胞色素C的提取与鉴定J南方农机201610232611王佺荃张文丽元小冬彭伟骆泓洁线粒体在细胞凋亡中的作用J中国医学创新201506303212赵丹贺莉芳刘晖李晓飞刘流晏容线粒体细胞色素CCaspase与细胞凋亡J医学动物防治201207202613朱玉山陈俭线粒体与细胞凋亡调控J生命科学201304222314李超伏圣博刘华玲马欣荣细胞凋亡研究进展J世界科技研究与发展201303182115马志科昝林森细胞色素C在生物医学方面的研究进展J畜牧兽医杂志201405172216方希敏陈铭珍陈日玲细胞色素C与细胞凋亡J国外医学临床生物化学与检验学分册201301353817刘畅王筠姜丁文内质网应激在高糖诱导心肌细胞凋亡中的作用J广东医学201201364018马志科昝林森张双奇秦川牛心肌细胞色素C提取纯化及鉴定的研究J家畜生态学报201403111319黄林陈传平马心细胞色素C含量测定的几种方法比较J安徽农学通报201513313320尹雪花新型纳米材料的制备及其在细胞色素C检测中的应用D湖南湖南大学201651